小反刍兽疫病毒感染性克隆的构建及H基因对病毒增殖影响的研究

小反刍兽疫是OIE规定必须上报的烈性动物传染病，随着小反刍兽疫在世界许多国家的暴发和流行，尤其在我国西藏地区的出现，对我国畜牧业的发展带来了严重威胁。因此，利用反向遗传操作技术构建感染性克隆，开展病毒基因结构与功能等基础研究显得十分重要。本项目利用基因工程技术构建负链RNA 病毒感染性克隆通用载体，以疫苗株75/1为母代病毒，采取分段克隆、逐步拼接方法构建全长cDNA分子。在细胞生物学水平上，利用体内转录法将全长感染性克隆转染真核细胞得到具有感染性的拯救病毒。最后在RNA水平及蛋白质水平上对拯救病毒的生物学特性及复制表达规律进行检测。以构建的感染性克隆为基础，采用基因缺失、突变或置换方法对病毒的H基因进行修饰，从突变的基因组cDNA分子拯救各种病毒突变体，通过分析H基因不同突变株的病毒增殖速率，研究H蛋白不同功能结构域对小反刍兽疫病毒增殖的影响。

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)感染山羊、绵羊等小反刍动物而引起的一种急性传染病，临床表现为发热、口炎、腹泻和肺炎等特征，发病过程以高发病率和高死亡率为特征。我国西藏阿里地区于2007年首次暴发PPR。近两年，新疆、内蒙古、辽宁、山东、湖南、安徽、广西、云南、贵州等22个省市相继发生疫情，小反刍兽疫防控任务十分严峻。通过该课题的实施，对PPRV感染性克隆的构建和病毒H基因对疫苗毒增殖影响的研究，了解PPRV的增殖规律，为PPR疫苗的研制提供了理论依据。.该研究结合当前副黏病毒科病毒感染性克隆的研究方法，通过对pBluescript® II KS(+)载体和pVAX1载体的改造，获得可作为通用型负链不分节段 RNA病毒的反向遗传载体，pBKS-HDV载体和pVAX1-HDV载体。在pBKS-HDV载体基础上构建了基于T7 RNA聚合酶启动子的含病毒基因组全长cDNA的质粒pBKS-PPRV Nigeria 75/1，在pVAX1-HDV载体基础上构建了基于CMV启动子的含病毒基因组全长cDNA的质粒pVAX1-PPRV Nigeria 75/1。以病毒全长cDNA为基础获得了辅助性质粒PCI-N、PCI-P和PCI-L。为能成功拯救PPRV全长cDNA，以EGFP报告基因为基础构建了微基因组pKS-LGT、pKS-HAM-TGL、PTVT-LGT和PTVT-HAM-TGL。通过将微基因组与辅助性质粒共转染的方式摸索病毒拯救的条件，依此来验证辅助性质粒的有效性，极大提高了全长病毒的拯救成功率。.成功克隆出山羊SLAM基因，通过对遗传抗性的筛选，成功构建稳定表达山羊SLAM受体的细胞系，为利用RNA聚合酶II拯救系统拯救PPRV病毒奠定了基础；构建了PPRV感染H基因表达的细胞，利用实时定量RT-PCR方法检测，发现H基因表达的细胞可以有助于PPRV增殖。.通过课题的实施，培养3名博士，5名硕士。发表科研论文14篇，其中SCI文章 4篇，申报国家发明专利1项，获得国家发明专利1项。