EB病毒潜伏感染驱动ZEB/miR-200"分子引擎"促进鼻咽癌EMT及肿瘤干细胞形成

Epstein-Barr virus (EBV) latent infection，Epithelial-mesenchymal transition (EMT) and formation of cancer stem cells(CSC)are crucial factor in the pathogenesis of Nasopharyngeal carcinoma (NPC). Here we hypothesis that is closely connected to each other by ZEB/miR-200 feedback loop, a vicious circle of the three procedures is involved in sustained undifferentiation, early metastasis and resistance to chemo-radio therapy of NCP. The aim of this study is to explore the modulation of ZEB/miR-200 loop in EBV latency/EMT/CSC circle in pathogenesis of NPC. By sorting cells by CD133 and ABCG-2 with FACS, we will observe the different expression of EBV-encoded genes, EMT markers as well as cell stemness signaling-pathway, and find out if we can modulate the ZEB/miR-200 molecular switch to break the EBV Latency/EMT/CSC vicious circle. With an EBNA1 targeted lentivious vector, we can over-expressing miR-200 in EBV latent-infected NPC cells both in vivo and in vitro, and finally develop a novel therapeutic strategy of NPC.

EB病毒潜伏感染、上皮-间质转化、肿瘤干细胞形成是鼻咽癌发生发展中的重要环节。鼻咽癌细胞内ZEB蛋白和miR-200形成的负反馈环，象一台持续转动"分子引擎"， 通过复杂的信号调控网EB病毒感染、上皮-间质转化、肿瘤干细胞形成是鼻咽癌发生发展中的三个络，推动三个环节相互促进，形成一个周而复始的恶性循环。本研究采用淋巴细胞与鼻咽癌细胞共培养技术，模拟鼻咽癌体内微环境，建立上皮-间质/溶解-潜伏动态转化细胞模型，分选具有干细胞潜能的亚群，观察ZEB/miR-200轴及其上下游信号调控网络的表达变化，分析EB病毒感染、鼻咽癌细胞上皮-间质转化和干细胞形成及干性维持影响。在此基础上，以EB病毒EBNA1基因识别的靶向载体，在鼻咽癌细胞内特异性表达miR-200，研究能否通过恢复ZEB/miR-200负反馈平衡 ，实现对EBV潜伏感染/EMT/肿瘤干细胞形成三个环节的同步干预，达到控制鼻咽癌的目的。

本课题在国家自然科学基金的资助下，围绕miR-200上下游调控通路，深入探讨了EB病毒潜伏感染在鼻咽癌发生发展中的重要作用。首次发现鼻咽癌细胞中存在ZEB/miR-200/CD47信号通路，初步证实miR-200/CD47表达失衡假说：鼻咽癌细胞中miR-200/CD47表达失衡是导致EB病毒潜伏感染状态，上皮-间质转化EMT和肿瘤干细胞形成的重要原因，miR-200a和CD47单克隆抗体，能够纠正miR-200a/CD47表达失衡，可能成为鼻咽癌精准治疗的全新策略。在研究过程中，发现肿瘤免疫治疗的重要靶点CD47蛋白，是miR-200的靶基因。为提高课题创新性，保持国际抗肿瘤免疫治疗最新突破同步，课题组对研究计划进行了重要调整，增加了大量新研究内容。首次开展鼻咽癌CD47调控和功能研究，以及CD47单抗免疫治疗实验。2018年诺贝尔奖归属肿瘤免疫治疗，以及《新英格兰医学杂志》报道CD47单抗治疗实体瘤的临床试验获得重大突破，均证实了这一调整的必要性。在研究方法上，本课题独创性的3D培养技术，建立了患者来源的鼻咽癌类器官体外模型，并采用感染EBV的淋巴瘤细胞与鼻咽癌类器官共培养技术，建立上皮-间质/溶解-潜伏动态转化细胞模型，模拟鼻咽癌体内微环境；还引入人源化免疫重建技术，成功建立鼻咽癌免疫重建动物模型PDIX，在鼻咽癌体外和体内研究模型上获得突破。课题主要研究结论：1.EBV潜伏感染能通过TGF-β1调节ZEB/miR200负反馈环的表达。2.CD47是miR-200的靶基因；鼻咽癌中CD47的高表达与临床分期及不良预后相关。3.EB病毒潜伏感染，导致鼻咽癌干细胞miR-200/CD47表达失衡，逃避巨噬细胞吞噬。4.miR-200a及抗CD47抗体能够纠正miR-200/CD47失衡，提高巨噬细胞对鼻咽癌细胞的吞噬能力。主要研究成果：以本课题成果为基础，申请人因《鼻咽癌转移相关标志物的筛选及其在预后预测中的应用研究》获得2017年中华医学科技三等奖。研究成果撰写并投稿研究论文4篇，其中2篇已分别被SCI期刊和核心期刊《中华肿瘤防治杂志》接收。培养2名博士3名硕士获得学位。课题组成员成功申报省市级课题3项。申请发明专利2项，专利实用新型专利1项。