转Bt基因棉花外源重组DNA土壤分布特征与水平转移研究

Recombinant DNA of transgenic plants can be released into soil from various sources including root exudates, pollen and decaying plant material. Bioavailable recombinant DNA, especially the antibiotic resistance genes can be taken up by the indigenous microorganisms and stably integrated into their genomes through the process of homologous recombination. This horizontal gene transfer from genetically modified plants to microorganisms may alter the structure and function of the soil microbial community, even cause long-term perturbation of the soil ecological system. The distribution and persistence of recombinant DNA in the soil environment and the possibility of horizontal gene transfer from genetically modified plants to soil microorganisms have been identified as an area of research and of possible environmental concern. Transgenic Bt cottons are the most abundantly grown and account for about 71.5% of the cotton acreage in China. Recently, ecological risk assessments of transgenic Bt cottons mainly include the impact on the number and diversity of insects, unintended effects in the diversity of soil microbial community, gene flow to wild relatives, evolution of resistant pests, exogenous protein residue, etc. However, the study on the distribution and persistence of recombinant DNA and its possible transfer to the microorganisms in the soil environment is very limited. The objectives of this research are to investigate the distribution and persistence of recombinant DNA and the possible transfer to soil microorganisms in a field experiment using real time PCR, colony hybridization method and sequence alignment analysis. The findings will enrich the connotation of safety evaluation system and provide an important theoretical basis for the comprehensive evaluation of the ecological safety of transgenic Bt cottons.

转基因植物通过根系分泌、花粉、残体等方式向土壤释放重组DNA，这些重组DNA尤其是抗性筛选标记基因很可能被土壤微生物通过同源重组方式整合到基因组中，造成微生物群落结构和功能的改变，甚至对土壤生态系统造成影响，重组DNA在土壤中的分布特征和水平转移成为急需解答的科学和环境问题。转Bt基因棉花是我国种植面积最广的转基因作物，其风险性研究主要从对农田生物多样性的影响、外源蛋白残留等方面开展，而对重组DNA在土壤中的分布特征及水平转移的研究甚少。本项目通过田间试验，采用荧光定量PCR、菌落southern杂交以及序列比对分析相结合的方法，研究重组DNA在土壤中的分布特征以及向土壤微生物的水平转移，为充实转基因抗虫棉花安全性评价体系内涵和综合评价转基因抗虫棉花的生态安全性提供理论依据。

转Bt基因棉花外源重组DNA在土壤环境中的动态变化及分布特征是转基因植物环境风险性研究的一项重要内容。本项目系统研究了转Bt基因棉花外源重组DNA在土壤中的动态变化、空间分布和抗生素抗性基因水平转移的发生情况，并研究了对土壤细菌和古菌群落丰度的影响以及对氨氧化微生物群落丰度和多样性的影响。主要研究结果如下：1）转Bt基因棉花外源35S-Cry1A片段和35S-NPTⅡ片段拷贝数均随棉花生长期的推进呈现先上升后下降的趋势，除2012年35S-NPTⅡ片段峰值在蕾期外，均在铃期。收获期外源重组DNA片段拷贝数与播种前差异不显著（p>0.05），但均显著低于蕾期与铃期（p<0.05）。2）转Bt基因棉花外源35S-Cry1A片段和35S-NPTⅡ片段在不同粒级土壤团聚体中分布特征一致，拷贝数最大值均出现在500 μm~2000 μm粒径范围内的土壤团聚体中，均显著高于其他粒径范围（p<0.05）。3）不同生长时期够检测到35S-Cry1A片段和35S-NPTⅡ片段地表节肢动物样品数量随棉花的生长期推进均呈现先上升后下降的趋势，但数量均很低，检出样品数量占总样品数量的比例在不同生长时期不同，同时能够在不同种节肢动物样品中检测到外源重组DNA的存在，说明外源重组DNA片段能够在食物链（食物网）中进行传递。4）不同生长时期土壤中均存在卡那霉素抗性细菌，克隆测序结果表明，抗性细菌的NPTⅡ基因序列与转Bt基因棉花插入的NPTⅡ基因序列不完全一致，未在土壤细菌中检测到转Bt基因棉花NPTⅡ基因序列。5）在整个生长时期转Bt基因棉花土壤中细菌16S rRNA基因丰度均低于对照，差异均不显著（p>0.05），土壤中古菌16S rRNA基因丰度也均低于对照，在蕾期和吐絮期差异显著（p<0.05）。转Bt基因棉花土壤中AOB和AOA优势种群与对照相同，随生长时期无显著变化，但在各自样品中所占比例不同。除铃期转Bt基因棉花土壤AOB丰度高于对照外，其它3个生长时期均低于对照；而AOA丰度在4个生长时期均低于对照。吐絮期时，转Bt基因棉花与对照土壤AOB和AOA丰度均差异显著（p<0.05）。转Bt基因棉花对土壤AOB和AOA群落结构组成无显著影响，但降低了细菌、古菌、AOB和AOA的数量，转Bt基因棉花可能对土壤微生物的某些类群存在潜在的影响。