核酸提取和多重PCR集成微流控芯片系统的研究

Nucleic acid extraction and multiplex PCR are the important technologies for molecular biology research and molecular diagnosis. However, there are some issues existed: 1) The nucleic acid extraction and multiplex PCR are conventionally performed in the open environment separately, which bring the risk of contamination and RNA degradation. 2) Multiplex PCR is an effective tool for simultaneous multiple target detection but is limited by the intrinsic interference and competition among primer pairs when it is performed in one reaction tube. The development of an integrated microfluidic analytical system is a solution to overcome the aforementioned problems. There are some reports about integration of nucleic acid extraction and PCR on chip, but multiplex PCR has not been integrated with nucleic acid extraction yet. Therefore, the aim of this project is to construct an integrated microfluidic system for on-chip nucleic acid extraction and multiplex PCR. The on-chip DNA extraction can be achieved based on the capture mechanism of nucleic acid adsorption to the surface of some materials, such as chitosan, and the extract-wash-release process can be accomplished with the external fluid control system. Besides, dividing a multiplex PCR into many single PCRs is a simple strategy to overcome the intrinsic interference of primer pairs. Due to the enormous advantages of microfluidics in flow manipulation and analysis, our microfluidic system has great potential to elevate the convenience of molecular diagnosis as well as reduce the contamination risk and cost. Through introducing microfluidics into nucleic acid extraction and multiplex PCR, we aim to provide a robust and convenient tool for molecular biology research and clinical applications.

核酸提取和多重PCR是分子生物学研究和分子诊断中的重要技术。但在应用中却常遇到以下问题：1）常规操作中，核酸提取和PCR是在开放环境中分开进行的，存在污染和RNA样品易降解的风险。2）多重PCR是一项多指标同步检测的技术，但多对引物之间的竞争和互相干扰使得体系构建非常困难。开发微流控芯片系统是解决以上问题的一个思路，目前已有在芯片上提取核酸并在单腔体PCR的报道，但尚无真正集成核酸提取和多重PCR的芯片系统被开发，因此这就成为本课题的目标。具体方案是在芯片的管道内壁修饰或填埋壳聚糖等核酸吸附物质，通过流体控制实现核酸的吸附-清洗-洗脱过程，而多重PCR的实现思路是利用微结构将PCR体系分割成多个独立的单重PCR体系，以多个单重PCR小体系来实现多重PCR。本课题拟构建的系统能从根本上降低核酸污染和降解的风险，解决多重PCR体系构建的难题，有望为相关研究和临床诊断开发更有效的核酸检测新技术。

核酸提取和多指标扩增检测是分子生物学研究和分子诊断的关键步骤，现有的常规操作却存在明显不足：1）分步操作有污染的风险，且操作繁琐，空间和人力占用高；2）多指标扩增检测在引物干扰等问题上的技术困扰。因此，本项目的核心思路是将核酸提取和分腔体的多指标检测集成在微流控芯片上实现，解决以上技术难题。.项目的主要工作集中在离心式微流控芯片工作所需的几个关键步骤：细菌的核酸释放、样本分配混合和多指标恒温扩增检测技术的研究上，以及为了实现上述目标而进行的芯片设计与加工、配套硬件的开发和测试、核酸扩增试剂的开发和在芯片上的测试等内容，最终提出了一套完整的基于离心式微流控芯片的细菌多指标检测方案。.该方案有如下技术优势：1）细菌的裂解通过旋转外部磁铁带动芯片上的搅拌棒运动从而让微珠碰撞细菌来实现，该过程中芯片保持静止状态，从而避免了阀的使用，简化了芯片的结构；2）整个检测过程在70分钟内以集成自动化的方式完成，适合对时效性要求较高的场合使用；3）反应结果可以通过荧光设备检测，也可直接肉眼判读，使得整个检测的适用性更强，适合资源有限的偏远地区使用。.在本课题的支持下，我们在离心式微流控中的流体操作关键技术、全集成核酸检测系统的开发、核酸提取新技术的开发等方面均取得不错进展，共发表SCI论文7篇，申请的发明专利中有3项获得授权。相关技术的开发不仅是本课题的完成的关键，也为后续技术的开发和创新打下基础。后续我们会在本课题的基础上进一步开发更符合临床需求、解决临床和科研应用痛点的微流控检测新技术。.总之，本课题构建的微流控系统从根本上降低核酸污染和降解的风险，解决多指标检测的难题。该系统具有很大的应用潜力，后续有望进行产业转化，成为支持相关研究和临床诊断的核酸检测新平台。