珊瑚菜磷脂酶GlNPC1基因鉴定及其应答盐胁迫的作用机制解析

Glehnia littoralis is an endangered, salt tolerant, medicinal halophyte. It is important to clarify the salt tolerance mechanism of Glehnia littoralis for restoring the genuine production and improving the medicine quality. Phospholipases hydrolyze phospholipids in response to salt stress signal. The applicant isolated a phospholipase gene GlNPC1 from the Glehnia littoralis comparative transcriptome analysis in response to NaCl treatment. It was found that the expression of GlNPC1 increased most significantly in all phospholipase-related genes. In this project, the biochemical studies on GlNPC1 would be characterized by bioinformatics and protein activity analysis. Transient RNA interference and gene overexpression technique would be used to silence and over-express GlNPC1 in Glehnia littoralis protoplasts. Together with experiments of functional complementation in Arabidopsis mutant, phospholipid content determination, and stress-related gene expression, the mechanism of GlNPC1 in response to salt stress would further be confirmed in cellular and plant levels. Moreover, the expression pattern of GlNPC1 would be explained by subcellular and tissue localization. All the results of this project would reveal the phospholipase signaling pathway that respond to high salt stress in Glehnia littoralis, and provide useful information and gene resource for breeding salt tolerant Glehnia littoralis.

珊瑚菜是一种濒危的盐生药用植物，阐明其耐盐分子机理对于恢复该药用植物道地产区种植、提高药材品质具有重要意义。磷脂酶代谢膜脂，参与感受、应答盐胁迫信号。通过珊瑚菜盐胁迫差异转录组分析，挖掘到一个受盐极显著诱导的磷脂酶GlNPC1。我们将以GlNPC1为研究对象，通过生物信息学与蛋白体外活性分析，明确其酶活特征；利用RNA瞬时干扰和基因过表达技术，在珊瑚菜原生质体中沉默或过表达GlNPC1，结合拟南芥突变体功能互补验证、脂组学分析及胁迫相关基因表达等研究，在细胞、植株水平上明确GlNPC1对植物耐盐性的调控作用及其可能的分子机制；并利用GlNPC1亚细胞与组织定位，明确珊瑚菜GlNPC1表达调控模式。本项目研究结果将揭示基于磷脂酶介导的珊瑚菜应答高盐胁迫的分子信号通路，为珊瑚菜耐盐分子育种提供基因资源和理论依据。

珊瑚菜是一种生在沿海沙滩地带的盐生药用植物，具有很高的生态和经济价值。目前面临栽培品种耐盐性退化，药材质量参差不齐等问题。进行珊瑚菜的抗盐胁迫研究，对加速珊瑚菜品种遗传改良，恢复道地产区种植具有重要的意义。. 本研究从珊瑚菜中克隆出一个受盐胁迫显著诱导的非特异性磷脂酶C基因GlNPC3（同GlNPC1），并对其进行生物信息学分析及一系列生物学功能研究，最终解析GlNPC3参与应答高盐胁迫的作用机制。在拟南芥中过量表达GlNPC3，转基因植株耐盐性有明显提高，盐处理下，过表达GlNPC3的植株主根长度、干、鲜重均显著高于野生型，证明GlNPC3在植物抗盐过程中有积极作用。GlNPC3基因表达模式分析显示，该基因在多数组织中均有表达，根中表达最为强烈。亚细胞定位显示GlNPC3主要在质膜和液泡膜上表达。体外酶活实验表明GlNPC3可水解磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC），并受盐诱导激活。通过分析盐处理前后转基因拟南芥的磷脂含量，包括磷脂底物、产物信号分子二酰甘油（DAG）和磷脂酸（PA），显示GlNPC3过表达植株的磷脂组成与野生型相比，发生了不同程度的变化，影响膜环境对盐胁迫的响应。此外，我们在珊瑚菜中建立了病毒介导的基因沉默（VIGS）技术，解决珊瑚菜无遗传转化体系下自身基因功能验证问题。通过VIGS下调珊瑚菜叶片中GlNPC3基因表达水平，再经盐处理分析发现，一些与胁迫相关的基因表达水平有明显的下调，如SnRK2、P5SC5、TPC1和SOS1等。综上，本项目验证了GlNPC3 在珊瑚菜响应盐胁迫中具有重要功能，并揭示了GlNPC3介导的磷脂信号转导与盐胁迫应答之间的潜在联系。. 本项目已顺利完成研究任务，达到研究目标，已发表受标注的SCI研究论文3篇，其中一篇影响因子>5，并授权国家发明专利一项，在申请的国家发明专利两项。