水稻条纹病毒介体灰飞虱传毒相关蛋白基因的克隆及功能研究

在自然条件下，水稻条纹病毒（RSV）主要由灰飞虱以持久性增殖方式传播，灰飞虱传毒与否在条纹叶枯病的流行中起着至关重要的作用。本项目拟针对昆虫介体传播植物病毒这一热点问题，采用酵母双杂交等分子生物学技术分离、筛选活跃传毒型灰飞虱体内与传毒相关的蛋白及基因，并通过显微注射和蛋白印迹覆盖技术验证其功能。利用制备的抗血清和免疫组织化学手段明确传毒相关蛋白在活跃传毒型和非活跃传毒型灰飞虱及其后代体内的时空分布，进一步验证介体传毒相关蛋白的可靠性，并结合病毒在介体内的循环途径，探索灰飞虱传播RSV的分子机制，为进一步利用传毒相关蛋白基因从根本上切断介体灰飞虱传播病毒,控制水稻条纹叶枯病流行奠定基础，具有重要的理论和实践意义。

由水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）引起的条纹叶枯病是温带和亚热带稻区最重要的病毒病害之一。自然条件下主要由介体灰飞虱以持久性增殖方式传播，介体传播病毒的过程是水稻、病毒、介体三者相互识别、共同作用的结果。病毒在介体内复制、传播等过程，不仅取决于病毒自身的因子，还须通过与介体蛋白互相作用，借助介体蛋白突破介体内的传播屏障，到达昆虫唾液腺，再随唾液的分泌、取食等完成侵染寄主植物的过程，因此介体昆虫传毒与否在病害流行中起着重要的作用,对灰飞虱传播RSV机制的研究具有重要理论和实践意义。本项目采用酵母双杂交、共聚焦显微镜、RNA干扰、生物学测定等技术手段鉴定了RSV传毒介体内的传毒相关蛋白，并验证了其生物学功能，主要结果有：1）构建活跃传毒型灰飞虱种群cDNA文库，以RSV CP基因为诱饵，捕获到灰飞虱体内与传毒相关蛋白基因114个；互作验证及Blast结果表明卵黄蛋白原（Vg）、RR1家族的表皮蛋白（NCuP）、核糖体相关膜蛋白、钙转运ATP酶等12种介体蛋白与RSV的CP互相作用；进一步通过免疫共沉淀技术确定5种介体蛋白与RSV的CP有强的相互作用，从强到弱依次是NCuP、Atlastin，Jagunal，Vg和NAC domain的蛋白。2）根据RSV在灰飞虱体内可以增殖、且可经卵传递等生物学现象，选择性克隆了NCuP和Vg全长基因（NCBI登录号为KC485263和KC469581），从分子水平上分析了基因结构。3）研究了NCuP的生物学功能。首先在Sf9细胞内证明NCuP与RSV CP可以互相作用。在介体体外，NCuP与RSV病毒粒子在灰飞虱细胞系和血细胞内结合；在介体内，在灰飞虱体内则共定位在血细胞中，但在肠道内没有观察到共定位。当敲除NCuP基因后，CP的表达量下降（降低65%），传毒率大大降低（下降40%），说明NCuP可能在介体传毒过程中帮助病毒逃避宿主血淋巴的免疫作用，从而保护病毒不被降解，使得病毒成功增殖传播。4）对Vg在灰飞虱体内的时空分布及生物学功能研究表明，Vg与RSV有相互作用，Vg在进入成虫期后表达量则迅速增加。在灰飞虱卵的发育过程中，病毒首先与Vg互作，然后由Vg的受体把病毒带入灰飞虱卵巢的生殖区，最后通过滋养丝进入卵母细胞，随着卵母细胞进而传递给后代，因此卵黄蛋白原在RSV经卵传递给后代的过程中起到重要作用。