蜂毒素通过TRIM47/PPM1A/Smads通路抑制肺纤维化的机制研究

Idiopathic pulmonary fibrosis can eventually lead to respiratory failure, and the main pathogenesis of traditional Chinese Medicine is "blood stasis". Melittin has the function of activating blood circulation and removing blood stasis, and can attenuate the degree of liver fibrosis. Based on the theory of homotherapy for heteropathy, we propose the idea of melittin against pulmonary fibrosis. It was also confirmed that melittin could effectively inhibit bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice by our research group. Previous transcriptome sequencing results showed that melittin can significantly down-regulate the expression of Tripartite motif-containing 47(TRIM47), and TRIM47 is highly expressed in patients with pulmonary fibrosis, so TRIM47 may be a key target gene of melittin. The latest research indicates that TRIM family members can down-regulate the protein phosphatase 1A (PPM1A) expression,and previous studies confirmed that PPM1A inhibits activation of TGF-β/Smads pathway through dephosphorylation, and Therefore, we propose a scientific hypothesis: melittin plays an anti-pulmonary fibrosis role by regulating the expression of TRIM47/PPM1A and inhibiting TGF-β/Smads pathway. Based on this hypothesis, the project will combines high-throughput sequencing, bioinformatics, animal experiments and molecular biology, and further explore the mechanism of melittin inhibiting pulmonary fibrosis through TRIM47/PPM1A/Smads pathway, in order to provide theoretical and experimental basis for the clinical application of melittin in the treatment of pulmonary fibrosis.

特发性肺纤维化最终可导致呼吸衰竭，其中医病机主要为“血瘀”，蜂毒素“活血化瘀”可改善肝纤维化，故基于异病同治理念，我们提出蜂毒素抗肺纤维化的思路。课题组前期已证实蜂毒素能有效抑制小鼠肺纤维化，并通过转录组测序，发现蜂毒素可显著下调三基序蛋白47(TRIM47)，进一步证实该基因在肺纤维化患者高表达，故推测其可能是蜂毒素作用的关键靶点。根据最新文献报道：TRIM家族成员可以下调蛋白磷酸酶1A（PPM1A）；结合已有研究证实PPM1A通过去磷酸化抑制TGF-β/Smads通路，我们由此提出科学假说：蜂毒素通过调节TRIM47/PPM1A表达以抑制TGF-β/Smads通路发挥抗肺纤维化作用。围绕该假说，本项目将高通量测序、生物信息学、动物实验及分子生物学多层次有机结合，深入探讨蜂毒素通过TRIM47/PPM1A/Smads通路抑制肺纤维化的机制，为蜂毒素抗肺纤维化的临床应用提供理论和实验依据。

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种难治性呼吸系统疾病，临床上以限制性通气功能障碍、进行性弥漫性肺间质纤维化为特征，最终可导致呼吸衰竭，预后极差。现有治疗手段虽能在一定程度上缓解病情，但对于肺纤维化的逆转较为有限。由于肺纤维化的中医病机主要为“血瘀”，蜂毒素“活血化瘀”可改善肝纤维化，故基于异病同治理念，我们提出蜂毒素抗肺纤维化的思路。我们通过转录组测序筛选并锁定了蜂毒素作用的关键靶点三基序蛋白 47（TRIM47）。基于前期研究基础，我们提出了科学假说及研究内容：蜂毒素通过调节TRIM47/PPM1A表达以抑制TGF-β/Smads通路发挥抗肺纤维化作用。.围绕该假说，我们开展了一系列研究，并取得如下成果：在动物实验中，我们发现蜂毒素干预后，可明显改善博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化病理程度，并显著降低肺纤维化相关细胞因子的含量。同时，在细胞实验中发现，蜂毒素能有效抑制人胚胎肺成纤维细胞（HELF）的增殖，且其作用呈时间和浓度依赖性，并能降低羟脯氨酸（Hyp）水平，说明蜂毒素能减少肺纤维化病程中的胶原蛋白的含量。我们发现特发性肺纤维化患者中TRIM47的表达水平较健康人群明显升高。在干扰TRIM47后，抑制了α-SMA、CTGF蛋白的表达，因此提示：降低TRIM47的表达能够抑制肺纤维化。我们进一步研究证实：TRIM47可上调Smad2/3的磷酸化水平，诱导PPM1A泛素化降解，降低蛋白磷酸酶1A（PPM1A）水平。同时，我们发现蜂毒素可以下调TRIM47的表达，并抑制TRIM47诱导的Smad2/3磷酸化，其作用相当于与TGF-β/Smads阻断剂(SB431542)的效果。最后，通过小鼠成纤维L929细胞免疫共沉淀试验，我们证实TRIM47和PPM1A可以互相作用，并且TRIM47过表达促进PPM1A的泛素化降解。因此，通过该项目的研究，我们证实蜂毒素通过下调 TRIM47，减少 PPM1A 的泛素化降解，抑制TGF-β/Smads 通路发挥抗肺纤维化作用。本项目将高通量测生物信息学分析、动物实验、基因干扰和过表达及分子生物学等实验手段有机结合，多层次深入探讨蜂毒素在肺纤维化治疗中的作用机制，为抗肺纤维化药物研究提供新的思路，同时也为蜂毒素应用于肺纤维化的临床治疗奠定理论和实验基础。