硫化氢对血管平滑肌细胞增殖过程的染色质重塑调控机制研究

在本课题组前期研究发现硫化氢作为重要的气体信使分子能够抑制血管平滑肌细胞的增殖的基础上，本工作拟从染色质结构重塑调控基因表达的"表观遗传调控"角度，检测H2S干预前后参与调控血管平滑肌细胞增殖的MAPK信号通路中起始作用基因NGF、NT3、FGF、PDGF及MEK5启动子区域染色质重塑复合物募集状态，染色质重塑与基因差异表达关系；通过高表达染色质重塑复合物SWI/SNF重要亚基SNF2家族中smarca 4基因编码蛋白，检测染色质重塑复合物的募集、染色质构型重塑及基因差异表达，以期揭示硫化氢通过下调SNF2家族蛋白，调控MAPK信号通路起始作用基因启动子区染色质重塑复合物的募集、重塑局部染色质构型以实现抑制血管平滑肌细胞增殖的染色质重塑调控机制。该工作将有利于探讨H2S在高血压等多种心血管疾病发病机制中的地位和作用，对正确认识硫化氢在维持机体稳态调节机制中有重要科学意义。

血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移是血管增殖性疾病发病的核心环节。心血管系统中的组织重塑是一个促增殖和抗增殖的调节平衡过程，血管增殖性疾病成功的药物治疗方案也主要通过抑制VSMC而发挥作用。硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)可通过抑制MAPK信号途径抑制内皮素-1（endothelin-1，ET-1）诱导的VSMC增殖，但其机制尚未完全明了。本研究以ET-1诱导VSMC增殖为模型，证实H2S抑制VSMC增殖过程中在转录水平对相关基因表达的调控，特别是在染色质水平的表观遗传调控机制。.第一部分通过ET-1诱导VSMC建立增殖模型，给予外源性H2S供体（NaHS）干预，以基因芯片筛选并经PCR、Western blot验证发现H2S可下调MAPKs信号通路中PDGFα、NTF3及PCNA表达；采用DNaseI高敏性分析技术找到PDGFα、NTF3及PCNA基因DNaseI敏感性位点 (hypersensitive sites, HS)，并证实H2S可引起其中PCNA-HS1、PCNA-HS2、PCNA-HS3、PDGFα-HS1、NTF3-HS1 及 NTF3-HS2区域发生染色质重塑。该部分研究证实H2S可通过重塑MAPKs信号通路PDGFα、NTF3及PCNA基因局部染色质结构，下调基因表达，进而抑制VSMC增殖，首次揭示了H2S抑制VSMC的表观遗传学调控机制。.第二部分在基因芯片筛选、PCR及Western blot验证后找出H2S重塑局部染色质的表观调控介质BRG1，经双萤光素酶报告基因技术证实H2S可直接抑制ET-1诱导的VSMC细胞内BRG1基因转录启动；采用染色质免疫沉淀（ChiP）技术证实H2S在抑制VSMC增殖的过程中阻碍了BRG1在差异表达基因启动子区的募集。通过对VSMC中BRG1基因过表达以及RNAi后检测ERK活性及PCNA表达，证实对BRG1介导的染色质重塑复合物的调控是H2S对VSMC增殖抑制必经的基因表达调控通路。该部分结果显示H2S通过抑制增殖的VSMC中ATP依赖的染色质重塑复合物SWI/SNF亚基BRG1的转录激活、转录活性、蛋白表达及其在基因启动子区的募集，实现其对基因局部性的染色质结构重塑的调控。BRG1介导的染色质重塑是H2S调控基因表达过程的重要表观遗传学调控方式。