结核分枝杆菌可逆调控效应分子(p)ppGpp合成与降解的分子机制研究

结核分枝杆菌能在人体内长期潜伏感染是结核病难以根治以及耐药型结核容易产生的重要原因。尽管已经证明，处于营养缺乏环境的结核分枝杆菌对其小分子效应物(p)ppGpp的代谢调控是病原菌应对环境胁迫和潜伏感染的重要策略之一，但相关的分子细节还不太清楚。针对这一问题，本项目拟以结核分枝杆菌中合成和水解(p)ppGpp 的双功能酶（Rel酶）为核心，综合采用细菌双杂交、表面等离子共振等技术，将Rel酶的C端在(p)ppGpp的合成和水解调控中的作用研究、可能参与该酶自身调控的关键氨基酸位点突变分析、以及新型调控功能蛋白的发现等研究有机结合，深入剖析Rel酶合成与水解(p)ppGpp这一可逆代谢调控过程的分子基础。本项目的成果将为最终揭示结核分枝杆菌潜伏感染的分子机制提供重要线索；同时，如能阐明关键代谢酶的功能，将可能发现新型抗结药物靶标，促进新药开发，因而具有重要的现实意义。

本项目综合采用细菌双杂交、表面等离子共振及薄层层析等技术，从蛋白质相互作用的角度研究了结核分枝杆菌中合成和水解(p)ppGpp 的双功能酶（Rel酶）的调控机制。本研究首先表达和纯化了结核分枝杆菌野生型Rel蛋白及Rel-N444截短片段，并测定了二者的(p)ppGpp合成功能，发现Rel-N444比Rel全长的活性要高。其次通过细菌双杂交技术和生物信息学分析方法，筛选到两个能与Rel相互作用的转录因子：Rv2745c和Rv3066，并深入研究了二者与Rel在物理和功能上的相互作用关系。在Rv2745c的研究中，通过pull-down技术进一步证明了Rv2745c与Rel的物理相互作用，并且发现Rv2745c能促进Rel的(p)ppGpp合成功能。同时通过筛选与Rel没有相互作用的Rv2745c突变体，进一步确定了Rv2745c对Rel的调控功能。Rv3066主要通过调控Rv3065的表达从而调节药物的排出。在Rv3066与Rel的研究中，除进一步证实Rv3066与Rel的物理相互作用关系及Rv3066促进(p)ppGpp合成功能外，还发现Rel全长及Rel-N444能促进Rv3066结合Rv3065的启动子片段，从而将(p)ppGpp代谢和药物排放结合在一起，为我们进一步研究结核分枝杆菌潜伏感染和药物之间的关系奠定了基础。