结核分枝杆菌双组份系统激酶TrcS磷酸化复制起始蛋白DnaA促进细菌应对胁迫压力的分子机制研究

DNA replication initiation regulation is essential for dormant infection and survival of Mycobacterium tuberculosis in the host. However, our understanding on underlying molecular mechanism is still largely incomplete. In previous studies, we found an interaction between kinase TrcS of two component system and replication initiator DnaA in Mycobactium tuberculosis. In addition, the phenomenon of phosphate transition was embraced by TrcS and DnaA. This project will focus on systematically studying the molecular mechanism of phosphate transition from TrcS to DnaA, and its effective mechanism of Mycobacterium tuberculosis responding environmental stresses. First, phosphorylation sites of DnaA will be identified by mass spectrometry. Second, molecular mechanism of phosphate transition from TrcS to DnaA will be illustrated by bacterial two-hybrid system, Co-IP and SPR assays. Third, the physiological roles of phosphate transition from TrcS to DnaA will be analyzed by identifying the bacterial growth and morphology of strains expressing abnormally TrcS under stressful conditions and phosphorylation of DnaA with these strains. The results will elucidate the regulation mechanism of phosphorylation of DnaA in Mycobacterium tuberculosis and its roles on pathogen responding environmental stresses.

DNA复制起始调控对于结核分枝杆菌的潜伏感染和在宿主中的生存十分关键，然而相关分子机制尚不清楚。申请人团队前期研究发现结核分枝杆菌双组份系统激酶TrcS与复制起始蛋白DnaA之间存在相互作用，并且二者之间存在磷酸转移现象。本项目将结合遗传学和分子生物学技术手段系统研究TrcS磷酸化修饰DnaA的分子机制及其对结核分枝杆菌应对环境压力的作用机制。首先采用质谱分析技术鉴定DnaA的磷酸化位点；进而应用细菌双杂交系统、Co-IP及SPR技术鉴定TrcS磷酸化修饰DnaA的分子机制；最后通过监测环境胁迫条件下trcS基因异常表达菌株的生长变化情况及菌株中DnaA的磷酸化状态，鉴定TrcS磷酸化修饰DnaA的生理功能。研究结果将阐明结核分枝杆菌的DnaA磷酸化修饰调控机制及对病原菌应对环境胁迫的作用机制。

结核分枝杆菌DNA复制起始过程与病原菌生长和繁殖相关，是该病原菌潜伏生长的原因之一，影响结核病的治疗效果。本研究在结核分枝杆菌中成功鉴定到与DNA复制起始蛋白DnaA具有相互作用的蛋白TrcS，该蛋白为双组份系统TrcS/TrcR中的传感蛋白，能够感受外界环境的变化。通过细菌双杂交实验和表面等离子共振实验进一步证实了DnaA和TrcS的相互作用，并且发现与DnaA相互作用的结构域为TrcS的C端结构域，该结构域具有磷酸化作用。磷酸化实验分析发现TrcS不仅具有自磷酸化功能，还能通过DnaA蛋白上的Thr472位点磷酸化该蛋白，将外界环境压力与DNA复制过程联系起来。DnaA蛋白被磷酸化后能降低该蛋白结合复制起始原点OriC的活性。相比于野生型BCG菌株，敲除TrcS/TrcR的BCG菌株在双氧水胁迫条件下的生长降低，表明TrcS磷酸化DnaA的过程调控了细菌的生长过程。这些结果为系统理解结核分枝杆菌潜伏感染过程与外界环境压力之间的关系提供线索，也为最终控制结核分枝杆菌感染提供潜在药物靶标。