EV71病毒感染介导Sam68调控PI3K/AKT信号通路的分子机制

Enterovirus 71 (EV71) is a non-enveloped single-(+) strand RNA virus of the Picornaviridae family, genus Enterovirus. EV71 infection mainly caused several epidemics of hand-foot-and-mouth in young children. Previous reports suggested that EV71 activated PI3K/AKT pathway to delay host cell apoptosis in an early infection. However, the potential mechanisam remains unclear. Sam68 belongs to members of the STAR family (signal transduction and activation of RNA metabolism)and c-Src/PI3K signal pathway, which participates in cell cycle, proliferation and signal transduciton. Our previous study indicated that EV71 3C protease triggered the export of Sam68 from nucleus during virus infection. The activation of PI3K/AKT was significantly down-regulated by silence of sam68 gene. At the same time, the replication of EV71 was notably inhibited. The Co-Immunoprecipitation (CoIP)further confirmed the interaction between Sam68 and PI3K p85 subunit. These data suggested that Sam68 plays an importan role in modulating activation of PI3K/AKT signal pathway in the upstream. Next, we will use overexpression, protein interaction, mutation analysis and RNA interfere, and so on, to study molecular mechanism of PI3K/AKT activation modulated by Sam68 at gene level, transcritional level and protein level, which will further provides a new basis to elucidate molecular mechanism of EV71 virus infection.

肠道病毒71型(Enterovirus 71)属于小RNA病毒科，肠道病毒属，为无囊膜的单股正链RNA病毒，主要引起婴幼儿手足口病。在病毒侵染早期，EV71激活宿主细胞PI3K/AKT信号通路以延迟细胞凋亡，但激活机制尚不清楚。Sam68是一种STAR接头蛋白，属于c-Src/PI3K通路信号分子，在细胞周期、增值分化及信号转导中发挥重要作用。前期研究发现：EV71感染细胞后，病毒3C蛋白酶介导Sam68出核；基因沉默sam68后，显著抑制 PI3K/AKT的激活及病毒复制；CoIP进一步证实Sam68与PI3K P85亚基存在相互作用，这些结果说明Sam68为PI3K/AKT上游重要的调控分子。本研究将采用过表达、蛋白互作、突变分析、RNA干扰等技术，在基因、转录和蛋白水平，研究Sam68调控PI3K/AKT信号通路的分子机制，为进一步阐明EV71病毒感染的分子机理奠定相关的基础。

在EV71病毒感染早期，病毒的3C蛋白酶介导核蛋白Sam68迁移至细胞质，与EV71病毒在细胞质共定位。构建的Sam68 ShRNA显著抑制Sam68蛋白表达，且转染Sam68 shRNA显著抑制病毒的复制，表明Sam68可能是参与EV71病毒复制的宿主因子。EV71病毒感染引起Akt的磷酸化，是通过磷酸化PI3K p85途径引起的，呈现PI3K依赖性。Sam68与PI3K p85亚基相互作用，参与PI3K/Akt通路的活化，是EV71病毒感染激活Akt通路的上游调节分子。与此相反，沉默Sam68蛋白显著降低Akt的磷酸化。此外，Sam68作为一个新的ITAF因子，特异性结合EV71病毒的5’非编码区。EV71病毒的IRES区（茎环IV和V）和Sam68蛋白的KH结构区，是两者互相作用的区域。过表达Sam68正向调节IRES依赖性的蛋白翻译。而沉默Sam68蛋白的表达，IRES依赖性的翻译和病毒的复制均显著下降。沉默Sam68的细胞感染EV71病毒后，发现Sam68对病毒基因组复制的影响较小。这些实验结果说明，在EV71病毒感染激活PI3K/Akt通路中，Sam68不仅是该通路的一个重要信号调节分子，而且作为ITAF因子，与EV71病毒的IRES相互作用，并正向调节EV71病毒蛋白的翻译，从而增强病毒的感染性。.我们还发现EV71病毒感染RD细胞后，促细胞凋亡蛋白Bax的构象发生了改变，Bax从细胞质转移至线粒体。随后，细胞色素C从线粒体释放进入细胞质，引起细胞的凋亡。同时EV71病毒的感染激活了JNK激酶。JNK激酶的特异性抑制剂能够显著抑制Bax的激活和细胞色素C的释放，说明EV71病毒引起的细胞凋亡是Bax依赖性的。EV71病毒感染RD细胞后，应用wortmannin抑制PI3K/Akt通路，JNK的磷酸化和JNK介导的细胞凋亡显著增加。此外，抑制PI3K/Akt通路显著降低ASK1激酶的磷酸化，而且负向调控ASK1的激酶活性。沉默ASK1蛋白显著降低JNK激酶的磷酸化，说明Akt磷化ASK1之后，抑制ASK1对JNK的磷酸化。因此，这些结果证实，EV71病毒感染RD细胞后激活PI3K/Akt，通过磷酸化ASK1并负调控ASK1激酶活性，阻断JNK通路，从而抑制细胞的凋亡。