Rv2324调控结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药的分子机制

Tuberculosis (TB), caused by mycobacterium tuberculosis (MTB), is a major communicable diseases, which seriously damage to the public health. At present, the serious TB prevalence and drug-resistant status at home and abroad. Especially, the percentages of ethambutol-resistant TB patients has been rapidly rising in recent years. Therefore, it is important that, by in-depth study, found the molecular mechanism of ethambutol resistance for impoved the diagnosis of ethambutol-resistant and the prevention and control of tuberclosis. Our previous study found that the Rv2324 was closely related to ethambutol resistance. After Rv2324 knockout, the mutant M.bovis BCG can resist to ethambutol obviously compared to wild type strains. And bioinformatic analysis and the results of real-time PCR demonstrated that the embC, a ethambutol resistant-related gene, might be the target of Rv2324. The results indicated that the ethambutol-resistant.phenomenon may be due to the over expression of embC, regulated by Rv2324. So this topic will identify the molecular mechanism of ethambutol resistance caused by Rv2324 control embC expression, and the function structure of Rv2324 domain, by using genetic mutations technologies, the system of promoter reporter vectors and so on. By this study, we will preferably control the the ethambutol resistance.

目前国内外结核病疫情严峻，耐药问题突出。特别是，近年来我国结核病患者的乙胺丁醇 （EMB）的耐药率正呈现快速上升的趋势。因此，深入研究EMB耐药的分子机制对于耐药结核病 的诊断和防治具有重要意义。我们在前期研究中发现，缺失了Rv2324的M.bovis BCG对EMB耐药性明显增强；且生物信息学分析和定量PCR的结果显示EMB耐药相关基因embC可能是Rv2324的靶基因。基于此，我们认为Rv2324调控embC的过度表达是引起EMB耐药的重要原因。本课题拟通过鉴定临床分离的结核分枝杆菌EMB耐药和敏感菌株的Rv2324与embC表达和EMB的耐药的相关性；继而以构建Rv2324和embC不同表达水平的菌株和启动子报告载体为基础，深入解析Rv2324调控EMB耐药的分子机制，为EMB耐药的诊断和防治提供新靶点和新策略。

近年来我国结核病患者的乙胺丁醇的耐药率正呈现快速上升的趋势，然而临床中只有30-40%的乙胺丁醇耐药菌株的耐药机制是明确的，还存在大量未知机制和检测靶点尚未被发现。我们的前期研究发现结核分枝杆菌Lrp/AsnC转录因子Rv2324的表达与乙胺丁醇耐药密 切相关，其可能是通过调控结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药相关的embC基因的表达完成。基于此，本课题拟通过基因突变等技术进一步明确Rv2324调控embC表达而引起乙胺丁醇耐药的分子机制，对控制乙胺丁醇耐药具有重要意义。 .目前本课题基因敲除是本课题研究的关键技术难点，也是MTB基础研究领域的难点。传统的分枝杆菌基因敲除系 统具有操作复杂，重组效率极低的缺点。我们采用一种新的基因敲除技术，首先将构建一个表达RecT、RecE重组酶的BCG重组菌株，然后对重组菌株利用同源重组的方法进行基因敲除。我们选用了含loxp序列的筛选标签，以便于后续使用Cre酶进行无痕突变株的构建。经测序鉴定，我们获得了Rv2324基因敲除的重组BCG菌株。此外，我们应用还有强启动子Psmyc和GFP的大肠-结核穿梭表达载体pMN437构建了Rv2324的高表达BCG菌株。继而将 野生型BCG、Rv2324敲除的BCG菌株和Rv2324过表达的菌株培的Rv2324和embC的表达量进行检测，结果显示：相对于野生株，过表达株的基因表达量升高了6.2倍。而相对于野生株，embC在敲除株中表达量升高了6.4倍，而 在过表达株中其表达量与野生株没有显著差异。同时，我们利用Mgit960系统对三种菌株进行药敏鉴定，结果显 示：野生株和过表达株的为敏感，敲除株为耐药，进一步进行MIC检测，结果发现敲除株的MIC＞25 μg/ml。初步证实了Rv2324引起的EMB耐药与调控embC的表达密切相关。同时，我们也表达了Rv2324的蛋白，并进行临床菌株的收集工作和embC的启动子区进行了测序，结果显示：耐药菌株在-11、-16、-27和-48存在基因点突变/缺失。进一步利用Rv2324蛋白表达载体与embC启动子区构建单荧光报告载体系统，结果显示Rv2324可以负向调控embC的表达。为下一步利用EMSA及明确Rv2324蛋白功能结构域，阐明embC引起的乙胺丁醇耐药机制奠定工作基础。.