NAD合成酶NMNAT3调控线粒体氧化应激在癫痫发病机制中的研究

Epilepsy is a chronic diseases with the multiple etiologies. Currently the drug treatment is poor in about 30% patients with epilepsy, thus the study of its pathogenesis has important practical significance for the treatment of epilepsy. Mitochondrial oxidative stress generates excessive ROS and other free radicals which affect the function of GABAergic neurons and glutamate clearance, and induce an imbalance between inhibition and excitation of neurones. But the mechanism of the regulation of mitochondrial oxidative stress in the epileptogenesis is unclear. Studies have shown that NAD synthetase NMNAT3 regulates the function of mitochondrial oxidative stress. Our previous experiments found a significant reduction of NMNAT3 in the expression of human epilepsy specimens, which suggested NMNAT3 regulation of mitochondrial oxidative stress may play a role in preventing epileptogenesis. We hypothesize that the regulation of NAD synthetase NMNAT3 plays an important role in the epileptic pathogenesis of mitochondrial oxidative stress. On the one hand NMNAT3 may regulate aconitase and electron transport chain complex I activity which increase ATP synthesis; on the other hand it may also deacetylate SOD and enhancing its activity of scavenging free radicals, which reduce the free radical mediated damage for glutamine synthetase and GABAA receptors. This project would study the role of NMNAT3 in the epileptic pathogenesis of mitochondrial oxidative stress by the means of morphological, molecular biological, neural electrophysiological, behavioral methods and others.This research may provide new targets of new antiepileptic drugs in the future.

癫痫是一种多病因的慢性疾病，约30%的患者目前药物治疗效果不佳，深入研究其发病机制有重要意义。线粒体氧化应激产生过多的ROS等自由基，影响GABA神经元的功能和谷氨酸的清除，引起神经元兴奋性和抑制性的失衡，这是导致癫痫发病的重要因素，但线粒体氧化应激在癫痫发病中的调控机制尚不清楚。研究表明NAD合成酶NMNAT3具有调节线粒体氧化应激的功能，我们前期实验发现人癫痫标本中NMNAT3表达显著减少，提示NMNAT3可能发挥调控线粒体氧化应激的作用，阻止癫痫发生。我们的假说：NMNAT3能增强SOD清除自由基的能力，减少ROS对谷氨酸转运体和GABA受体的氧化损伤；同时调节呼吸链复合体I的活性，增加ATP合成，减少能量缺乏对GABA神经元功能的影响。本课题拟利用多种癫痫标本，通过分子生物学和神经电生理学等方法，揭示在癫痫发病中NMNAT3调控线粒体氧化应激的作用机制，并为癫痫药物治疗提供新靶点。

本项目主要研究进展和研究发现有以下几个方面：.①明确NMNAT3在癫痫中的表达情况。在癫痫患者病理标本和癫痫动物模型中通过qPCR和免疫印迹证实NMNAT3的变化，首次发现NMNAT3的两种不同亚型表达变化的差异，并明确NMNAT3v1亚型在癫痫组织中特异性高表达。.②发现NMNAT3不同亚型的细胞定位和功能差异。通过免疫荧光染色和电镜检测，确认NMNAT3v1亚型在胞质和线粒体均有分布，这一发现区别于之前文献的报道。利用免疫共沉淀联合质谱分析，我们发现NMNAT3v1能够与多种线粒体蛋白和胞质蛋白存在相互作用关系，进而影响线粒体代谢。.③基本确定NMNAT3v1亚型通过两个方面影响细胞抗氧化能力，一是下调部分抗氧化蛋白的表达水平，二是扰乱ATP的生成，破坏线粒体膜电势，增加线粒体ROS水平。我们进一步证实后者的调控机制是由于NMNAT3v1亚型不具有产生NAD的功能，干扰了sirt3对底物蛋白的去乙酰化修饰。.④发现在在体水平，海马区过表达NMNAT3v1亚型增加了匹鲁卡品诱导的癫痫发作的易感性。这一作用机制可能与神经元功能不足有关。.⑤证实NMNAT2的生物学功能和在癫痫发病中的作用。在本项目的研究中，因为NMNAT3v1同时也被发现定位于胞质，这与NMNAT家族成员的NMNAT2的细胞定位类似，因此，我们NMNAT拓展了研究范围，研究NMNAT2在癫痫中的作用。有意思的是，癫痫组织中表达上调的NMNAT2也表现出对神经元存活不利的一面。过表达NMNAT2增加细胞的凋亡，这一机制可能与AKT信号通路有关。.我们的研究发现NMNAT3v1表现出与NMNAT3完全不同的细胞亚区域分布和功能作用。特别是在癫痫组织中，NMNAT3v1表现出特异性升高的特点。这提示NMNAT3v1有可能成为癫痫病理诊断的新分子和药物治疗的新靶点。.我们的发现首次证实NMNAT3v1亚型在胞质和线粒体分布，而与其相互作用的蛋白有核糖体蛋白、HSP90和ATP酶亚基等,强烈的提示NMNAT3v1可能具有多种调控作用。