EphA2协同NRP1促进EBV进入上皮细胞的机制

Epstein-Barr Virus (EBV) is a ubiquitous human γ-herpesvirus that latently infects more than 90% of adults worldwide, causally associated with various B cell lymphomas, nasopharyngeal carcinoma and 10% of gastric carcinoma. EBV infects both B cells and epithelial cells. Recently, important progress has been made in elucidating the mechanism of EBV entering the epithelial cells. We recently reported that EphA2 and NRP1 promoted EBV internalization and fusion. Whereas, the coordinated mechanism of EphA2 and NRP1 involved in EBV entry is still unclear. Our preliminary experiment indicated that EphA2 interacted with NRP1. Moreover, NRP1 (or EphA2)-mediated EBV infection was dependent on the expression of EphA2 (or NRP1). Our project intends to investigate the process of single EBV entry into epithelial cells and the dynamic process between EphA2 and NRP1 by super resolution fluorescence microscopy (SRFM) combination with Fluorescence resonance energy transfer (FRET). Furthermore, we will demonstrate the kinetics between EBV glycoprotein gB and EphA2 or NRP1 by SPR technology (Surface Plasmon Resonance). Our project will further elucidate the mechanism of EBV entry into epithelial cells. The implementation of this project will provide an important theoretical basis and experimental basis for the prevention and treatment of EBV infection and related diseases.

Epstein-Barr Virus（EBV）与B细胞淋巴瘤、鼻咽癌和10%胃癌的发病密切相关。EBV主要感染B淋巴细胞和上皮细胞。近年来关于EBV进入上皮细胞机制的研究取得了重要进展。我们前期鉴定了宿主因子EphA2和NRP1促进EBV內吞和融合。然而，EphA2和NRP1在EBV进入过程中的协调机制尚不清楚。预实验结果显示，EphA2与NRP1结合，NRP1介导的EBV感染依赖于EphA2表达而EphA2介导的EBV感染也依赖于NRP1表达。本课题拟采用超分辨率荧光显微技术（SRFM）结合荧光共振能量转移技术（FRET）观察EBV进入上皮细胞过程中与EphA2及NRP1互作的动态过程，采用SPR技术研究EBV糖蛋白gB与EphA2及NRP1结合的动力学。本课题的实施将深入阐明EphA2和NRP1协同促进EBV进入的分子机制，为EBV感染及相关疾病的防治提供重要的理论基础和实验依据。

研究背景.每年有20万肿瘤和数百万非肿瘤病例与EBV感染相关。EBV主要感染B细胞和上皮细胞，多个病毒糖蛋白与不同宿主因子协同作用决定其宿主嗜性。我们在前期鉴定NRP1和EphA2是EBV感染上皮细胞关键宿主因子。我们进一步发现EphA2与NRP1结合，NRP1介导的EBV感染依赖于EphA2表达，反之亦然。然而EphA2和 NRP1在EBV进入过程中的协调机制仍不清楚。..主要研究内容.我们通过多种前沿技术探究EphA2和NRP1协同促进EBV感染上皮细胞的分子机制，并最终充分阐释不同受体协同介导EBV感染的分子机制，为EBV疫苗和靶向药物开发提供关键靶点。.1)分析EphA2二聚化/寡聚化状态在EBV感染上皮细胞中的重要作用；.2)探究EphA2在其他疱疹病毒感染中的重要作用；.3)构建荧光标记EBV，观察EBV入侵过程中与受体互作的动态过程；.4)纯化EphA2、NRP1与EBV糖蛋白gH/gL及gB，BLI分析NRP1和EphA2与EBV糖蛋白互作的动力学；.5)鉴定R9AP在EBV感染上皮细胞中的重要作用和关键分子机制；..重要结果、关键数据及其科学意义.1）我们发现配体结合能力缺失突变体EphA2R103E和寡聚体形成能力缺失突变体EphA2G131Y阻断EBV感染和融合，阐释了EphA2介导EBV感染的具体机制；..2）我们在前期证明EphA2介导EBV和KSHV感染的基础上，进一步发现EphA2是HCMV感染胶质母细胞瘤细胞的重要受体，为HCMV疫苗和靶向药物开发提供了关键靶点；..3）我们成功构建了荧光标记EBV，并实时观察到EBV入侵上皮细胞过程中与EphA2结合，为将来充分阐释EBV入侵分子事件奠定了技术基础;..4) 我们通过BLI分析了EphA2与EBV糖蛋白gH/gL和gB的亲和力分别为17.47 nM和149 nM，但未能检测到NRP1与EBV糖蛋白gB亲和力，且共表达NRP1和EphA2无法充分介导EBV感染不易感细胞系，表明存在其他关键宿主因子；..5）我们联合人类基因表达谱芯片、siRNA文库等技术鉴定了R9AP是EBV感染上皮细胞的关键受体，并阐释了R9AP协同NRP1和EphA2促进EBV感染上皮细胞，并获得了一个阻断EBV感染的R9AP短肽，实现了EBV感染理论的重要突破，并为EBV疫苗研发提供了关键靶点。