新疆地区Waardenburg综合征致病基因突变筛查及功能研究

Waardenburg syndrome (WS) is the most common autosomal dominant inherited disorder in syndromic hearing loss and is clinically and genetically heterogeneous. WS shows a group of clinical syndrome resulting from defects of neural crest cells (NCC) characterized by abnormal pigmentation and sensorineural deafness resulting from dysfunction of melanocytes.It has been confirmed in our preliminary studies that MITF, PAX3, and SOX10 are the main casutive genes in Chinese WS cases.The mutations of PAX3 and SOX10 result in synthesis disorder of melanin by downregulating the expression of MITF. MITF is a key transcription factor and master regulator in development of melanocytes and affects pigment synthesis through regulating the expression of TYR and DCT. But it has been remained unclear how MITF mutations cause WS in China.There is no research reported about WS in Xinjiang region ,in which the ethnic minorities of WS may own unique molecular genetic background. On the basis of preliminary study on WS, We intend to collect WS cases of Han and ethnic minorities in Xinjiang region to carry out mutation detection of WS casutive genes and further study the feature of molecular genetic background of WS at genomic level. We also intend to perform in vitro studies on function of WS casutive genes by generating mutant expression plasmids at molecular level and further study pathogenesis of WS at post-genomic level, which will fill WS reasearch gaps in Xinjiang.

Waardenburg综合征（WS）是最常见的常染色体显性遗传性综合征型耳聋，具有高度临床和遗传异质性。是神经嵴发育不全导致色素细胞功能不良而出现的以色素沉着异常和听力下降为主的一组临床症候群。我们的前期研究发现中国人群WS致病基因为MITF、PAX3和SOX10，PAX3和SOX10突变下调MITF表达导致黑色素合成障碍。MITF是调节色素细胞发育的关键转录因子和总调控因子，通过调控TYR和DCT表达而影响色素合成，国人MITF突变致WS的发病机制还不清楚。新疆地区尚未开展WS的相关研究，少数民族WS可能具有其独特的分子遗传背景。我们拟在前期WS研究基础上收集本地区汉族和少数民族WS病例，进行致病基因突变筛查与检测，在基因组水平研究本地区WS分子遗传背景特点；并构建新发突变基因表达载体通过体外实验在分子水平对致病基因的功能进行研究，在后基因组水平阐述WS发病机制，填补本地区WS研究空白。

Waardenburg综合征（WS）是最常见的常染色体显性遗传性综合征型耳聋，具有高度临床和遗传异质性。是神经嵴发育不全导致色素细胞功能不良而出现的以色素沉着异常和听力下降为主的一组临床症候群。主要致病基因为MITF、PAX3和SOX10，PAX3和SOX10突变下调MITF表达、MITF突变下调DCT和TYR表达导致黑色素合成障碍而导致WS。本研究对新疆及其他地区28例WS患者进行了临床诊断和分型（其中家系3个共13例，散发15例），WS1型5例，WS2型23例。共发现13种基因突变位点，MITF基因突变6种，SOX10基因突变5种，PAX3基因突变3种。其中3种为新发突变，SOX10基因突变p.Q355X（c.1063C>T）和p.G349VfsX8（c.104delG），PAX3基因突变 p.Q40X（c.118C>T）。少数民族WS发病率较汉族低，以家系遗传为主。我们利用这些突变对致病基因的功能进行相关的一系列体外实验研究，包括突变基因真核细胞表达载体构建、siRNA体外转染、Western blot检测蛋白表达、荧光素酶检测蛋白活性、细胞免疫荧光观察亚细胞定位、免疫共沉淀检测蛋白相互作用及染色质免疫共沉淀实验等，在转录和转录后水平研究突变蛋白功能改变及其对野生蛋白功能的影响。结果发现MITF突变蛋白通过下调酪氨酸酶基因表达以及PAX3突变蛋白失去与野生型SOX10的协同作用而下调MITF基因表达。LEF-1在β-catenin参与下上调靶基因TYR表达，并可与MITF协同转录激活TYR表达。因此，基因突变产生的突变蛋白的功能与其功能结构域关系密切，导致WS的发病机理主要是单倍体剂量不足效应。突变蛋白剂量不足以达到野生型蛋白行使正常生理功能的最低阈值而实现黑素细胞完全发育。MITF基因突变通过下调酪氨酸酶转录水平、PAX3和SOX10基因突变通过直接下调MITF转录水平，而野生MITF通过与LEF-1/β-catenin的相互作用影响Wnt/β-catenin信号通路，并最终影响黑素细胞发育并造成黑色素的合成、转运和分布障碍，导致虹膜、皮肤、内耳黑色素缺如而引起WS表型。