束缚应激对脑外伤后神经功能的影响及基于ERS-自噬调节通路的相关分子机制研究

Mild and moderate traumatic brain injury (TBI) often lead to the death of the individual in forensic practice, which is involved in the non-traumatic stress such as social, psychological and mental factors, but it is difficult to study the exact role and the participation of non-traumatic stress in clinical and forensic medicine research. We are focusing on the mechanism of neuronal cell death after TBI many years. To illuminate the effect and mechanism of non-traumatic stress in secondary brain injury after TBI, this project will be carried out as follows: (1) Using a mouse TBI model, a restraint stress model and an in vivo TBI + restraint stress compound model, to study the effect of restraint stress on secondary neuronal cell death and neurological dysfunction, together with the mutual regulation mechanism between endoplasmic reticulum stress (ERS) and autophagy after TBI. (2) Using an in vitro cell shearing device (VCSD) induced TBI model, an in vitro non-traumatic stress model and a combination in vitro model of TBI + non-traumatic stress, to prove non-traumatic stress could aggravate neuronal injury after TBI, and to further study the mutual regulatory mechanism between ERS and autophagy after TBI. The study will put forward the new theories about the non-traumatic stress aggravate body injury caused by traumatic stress, and provide the theoretical basis for forensic judicial identification of such cases.

在法医学实践中常常遇到轻、中度脑外伤（TBI）导致个体死亡的案例，此情况被认为是心理、精神等非创伤性应激因素的参与所造成，但其确切作用及参与度一直是临床及法医学研究的难点。为明确非创伤性应激对TBI后继发性脑损伤的影响及其机制，本项目在我们多年研究TBI后神经细胞死亡机制的基础上，开展如下研究：（1）采用小鼠TBI模型、束缚应激模型及TBI +束缚应激的复合性损伤模型，研究束缚应激对TBI后神经细胞死亡和神经功能障碍的影响，以及内质网应激（ERS）与自噬之间的相互作用机制；（2）通过建立体外神经元牵拉损伤TBI模型、体外非创伤性应激模型及TBI+非创伤性应激复合性体外模型，证明非创伤性应激可加重TBI后神经元损伤，进而研究ERS与自噬在TBI中的相互调节机制。上述研究将为揭示非创伤性应激加重创伤性应激所造成机体损伤的确切机制提出新的理论，为此类案件的法医学司法鉴定提供理论依据。

在法医学实践中常遇到轻、中度脑外伤（TBI）导致严重残疾甚至死亡的案例，此情况认为心理、精神等非创伤性应激因素参与所造成，但其确切作用及参与度一直是临床及法医学研究的难点。束缚应激（RS）模型是公认的较好的复制心理、精神应激的动物模型，既往研究认为RS可加重损伤或疾病。（1）本项目首先建立小鼠TBI模型，通过免疫印迹实验发现ERS相关蛋白p-eIF2α、GRP78及CHOP呈时序性表达表达，并于TBI后2d及3d呈现峰值表达；（2）免疫荧光实验（2d）发现 CHOP蛋白可与神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞和周细胞等NVU主要组成细胞共定位表达；（3）ERS抑制剂Sal连续给药可修复损伤的细胞质膜（2d）、改善运动功能（1-5d）、学习和记忆功能（10-14d）及减少脑缺损体积（21d）；（4）免疫印迹实验表明Sal（2d）可抑制TBI诱导ERS相关蛋白p-eIF2α、ATF-4、GRP78及CHOP的表达，逆转TBI诱导的凋亡过度激活（caspase-3、caspase-12 及Bcl-2），以及抑制自噬性死亡（LC3II、Beclin-1及p62）；（5）免疫荧光表明Sal（2d）可减少TBI后CHOP 和 TUNEL、CHOP 和LC3双阳性细胞。（6）进一步建立TBI+RS小鼠模型，发现RS可减少TBI后小鼠体重获得（2-7d），加重TBI引起的神经细胞质膜完整性破坏（3d），延迟TBI后运动功能的恢复（3-5d）；（7）免疫印迹实验发现RS（3d和7d）可过度激活TBI诱导的ERS、自噬和凋亡；（8）Sal（7d）可通过抑制ERS，自噬和凋亡而减轻RS对TBI的损伤作用；（9）免疫荧光（3d和7d）表明RS可减少TBI后CHOP和NeuN，CHOP 和APP，CHOP 和p-Tau，CHOP 和Ubi双阳性细胞。基于上述研究结果，ERS参与TBI后继发性损伤，抑制ERS可改善TBI后细胞质膜损伤和神经功能缺陷；RS可加重TBI后细胞质膜损伤和神经功能缺陷，并与ERS-自噬-凋亡途径的过度激活及神经退行性变加剧有关。因此，强烈的心理、精神等非创伤性应激可加重机体创伤性损伤，本研究结果为此类案件的法医学司法鉴定提供理论依据。