小麦种子中脂肪氧化酶基因的克隆及功能验证

小麦种子中脂肪氧化酶（lipoxygenase，LOX）对小麦的储藏、种子活力、营养与加工品质有重要影响，鉴定、克隆小麦种子中高量表达的LOX基因成员并对其进行功能验证是深入开展小麦LOX基因理论和应用研究的重要突破口。本项申请以小麦品种小偃54不同发育阶段的种子为研究材料，鉴定出小麦种子中高量表达的LOX基因成员，分离其全长cDNA序列并研究其在种子发育过程中的表达动态；利用小麦种子中高量表达的LOX成员的保守序列，采用小麦高分子量麦谷蛋白启动子来构建种子特异性RNAi表达框，利用基因枪法转化小麦幼胚，获得小麦种子中LOX活性显著降低的RNAi株系，并以此为试材，采用人工老化试验，研究LOX基因在小麦种子储藏中的作用。本项研究的结果有助于深入认识小麦LOX基因的分子生物学功能，并可为耐储藏小麦培育、小麦营养与加工品质改良提供理论指导和有益基因资源。

脂质的降解是粮食在储藏期间变质、产生陈味劣变以及种子活力降低的重要原因。在大豆、水稻中的研究表明，脂肪氧化酶（EC 1.13.11.12, Lipoxygenase, LOX）能催化氧分子与种子中多链不饱和脂肪酸反应，从而与粮食储藏过程中的变质密切相关。本研究获得了创新性的成果：.1：本研究首先从生物信息学角度和跨内含子保守引物PCR随机测序分析了普通小麦中LOX基因的拷贝数，结果表明，该基因在小麦基因组中的成员可能为37-41个。.2：同时从小偃54种子发育过程中分离了9个LOX基因，其中获得2个成员的基因序列。序列信息表明：种子中表达的LOX基因不含有叶绿体定位信号肽，其碱基长度与植物中典型的LOX相似。氨基酸序列的聚类分析发现，克隆的9个普通小麦LOX均为单子叶植物特有。.3：通过设计保守引物和6个成员的特异引物，我们研究了普通小麦小偃54、中国春、Opata85和W7984种子发育过程中LOX基因的表达。.4：通过在内含子区域设计引物，我们对获得的2个LOX基因进行了染色体定位，通过测定Opata85×W7984重组自交系群体种子的LOX酶活，发现种子中LOX酶活的主效QTL定位于小麦染色体4BS。.5：选择LOX基因的高度保守区段作为正反向片段，我们构建了用于转化的RNAi载体，通过基因枪介导的转化方式，我们转化了春麦陇春23号和冬麦科农199，成功获得了转基因阳性株系。对T1代种子的LOX酶活测定，发现部分株系的LOX酶活显著降低（40-60%）。.6：转基因株系的FISH验证：外源片段插入三个株系D1、D2、D7小麦染色体5D和7D。种子发育过程中LOX的定量PCR结果表明：转基因植株种子发育过程中LOX表达显著降低，且叶片中的表达不受转基因影响。