内质网分子伴侣Bip在镉致神经细胞衰老中的作用及调控机制

Cell senesence is an important form of cell damage. Senescence occurs closely assosiated with the levels of mitophagy and ER stress. Previous research of our group showed that neuronal senescence can be induced by cadmium(Cd). The ER chaperone Bip plays an important role in Cd-induced autophagy and senescence during neural damage. However, whether Cd-induced mitophagy is Bip dependent or not and the mechanism underlying the effect of Bip on Cd-induced senescence are both unclarified. In this program, we intend to employ PC12 cells and primary cerebral cortical neurons of rats as the cell model while using SD rat as animal model to: (1) Measure the effect of Cd on senescence in neurons and rat brains after chaning the expression levels of Bip protein. (2) Analyze the effect of Cd on cell cycle by knocking down Chop expression (3) Detect the level of mitophagy, interaction between Bip and the key regulator of mitophagy Pink1 and the distribution of MAM in both neuronal cells and cerebral cortex after changing the expression of Bip. (4) Measure the effect Cd on inflammatory pathway and Chop protein expression after knocking down Pink1. This study aimed to explore the regulation machenism underlying the of Bip on Cd-induced neural senescence, which can facilitate the understanding of Cd-mediated neural damage.

细胞衰老是细胞损伤的重要形式，细胞衰老的发生与线粒体自噬以及内质网应激程度有密切联系。前期研究表明，镉能够诱导神经细胞衰老，内质网伴侣分子Bip在镉致神经细胞自噬和衰老过程中发挥调控作用，但关于Bip是否参与镉致神经细胞线粒体自噬以及在镉致神经细胞线粒体自噬和衰老中的作用机制尚未完全阐明。本项目拟用PC12细胞系和原代大鼠大脑皮质神经元为细胞模型，以SD大鼠为动物模型：（1）通过改变Bip蛋白表达水平，检测镉对神经细胞和大鼠大脑皮质衰老的影响；（2）通过敲减Chop，分析镉对神经细胞生长周期的影响；（3）改变Bip表达水平后，探讨镉对细胞和组织中线粒体自噬水平，Pink1与Bip之间的相互作用及MAM的分布的影响；（4）敲减细胞和大鼠脑中Pink1后，检测镉对炎性通路及Chop蛋白表达的影响。从而明确Bip在镉致神经细胞衰老中的作用及调控机制，为进一步揭示镉的神经毒性损伤机理提供理论依据。

本报告旨在探讨镉诱导神经细胞线粒体自噬发生的机制在神经细胞损伤中的作用。方法：选用PC12细胞和大鼠原代神经元为细胞模型，经镉处理 6 h，利用透射电镜观察细胞中的线粒体自噬体；Western blot方法检测线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62等的表达；IF方法检测线粒体标志蛋白与自噬调控蛋白共定位。分别采用siRNA干扰技术、CRISPR-Cas9系统制备PINK1敲减、AMPK与MFN2敲除神经细胞模型，经镉处理后，检测细胞中线粒体自噬相关蛋白表达，线粒体标志蛋白与自噬调控蛋白共定位水平以及炎性因子调控蛋白的表达水平。结果显示：经镉处理后，与对照组相比，神经细胞中的线粒体自噬相关蛋白表达水平出现不同程度的升高或降低；PINK1siRNA预处理后，与镉单独处理组相比，线粒体自噬水平下降；与正常细胞相比，AMPK敲除后的细胞经镉处理后，PINK1、Parkin表达量减少，线粒体自噬水平下降；与正常细胞相比，PINK1、AMPK 表达缺陷的细胞经镉处理后炎性因子表达调控蛋白NLRP3和cleaved-Caspase1的表达水平均下降；镉诱导MAMs结构中关键调控蛋白Mfn2、Grp75、VDAC1等蛋白的表达，Mfn2敲除的细胞经镉处理后，与正常细胞相比，MAMs数量减少，自噬水平下降。以上结果表明，镉能够通过激活AMPK/PINK1/Parkin通路诱导神经细胞中线粒体自噬的发生，线粒体自噬能够抵抗镉诱导的神经细胞炎性损伤，并且能够抵抗细胞损伤，MAMs在此过程中发挥重要作用。