槟榔碱口服诱导小鼠口腔黏膜下纤维化模型的建立及VEGF基因诱导血管生成的实验研究

Oral submucous fibrosis (OSF) is a chronic oral disease, characterized by epithelial atrophy, collagen accumulation and microvascular changes. Accumulation of large amounts of collagen in the lamina propria, vascular occlusion and reduction is the major pathological changes of OSF. The main treatment is drug therapy and surgery. However, the surgery always resulted in great trauma and high recurrence rate. There are many types of drugs, but the treatment effects are poor. The vasodilator drugs are most frequently used in clinical,which physiological basis is considered that it induces angiogenesis, and the effectiveness of treatment also confirmed the correctness of this doctrine. However, since systemic administration, its side effects control and targeting characteristics were unsatisfactory. It is well known that vascular endothelial growth factor (VEGF) has strong angiogenic effect. In this project, we will construct naked plasmid expressing VEGF through transgenic technology, following direct local transfected into ischemic area of mouse OSF model, in order to recovery angiogenesis of oral lesions in ischemic area. Our group has established a mouse model of oral cancer lymph node metastasis induced by chemical drugs administration and applied a national patent.Using the similar method, moderate dysplasia was found by administration of high concentration arecoline for eight weeks, suggested that the establishment of a mouse OSF model has great possibility. Compared with other model methods with low concentration of the drug administration, the new method reduces the time to create the model, thus avoiding the influence of confounding factors caused by drug injection and coating.

口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF）是一种以上皮萎缩、胶原堆积和微血管改变为主的慢性疾病。病理特征是黏膜固有层胶原堆积，血管闭塞和减少；治疗上以药物和手术治疗为主，手术治疗创伤大，复发率高。药物治疗种类多，疗效均欠佳，其中扩血管药物在临床中最常用。其生理学基础认为是诱导血管生成，治疗的有效性也证实这一学说正确性。但由于全身用药，其副作用控制及靶向性均不令人满意。本课题利用血管内皮生长因子（VEGF）促血管生成作用，通过转基因技术构建VEGF表达裸质粒，直接对小鼠OSF模型进行局部转染，恢复病变区血管生成。本课题组已采用化学药物饮水法诱导建立了小鼠口腔癌淋巴转移模型，申请国家专利一项，相同方案采用高浓度槟榔碱饮水法，8周即发现中度异常增生，提示建立小鼠OSF模型极大可能。该方法避免了注射和涂布可能造成的混杂因素影响，通过高浓度药物诱导，减少成模时间。

研究背景：口腔黏膜下纤维性变（Oral submucous fibrosis，OSF）是一种以上皮萎缩、胶原堆积和微血管改变为主的慢性疾病。随着社会经济文化交流的日益扩大以及槟榔产品的商业化，OSF 呈现向全国蔓延的趋势，OSF的患病人数逐年增加。但是现今尚无有效的治疗方法。其中扩血管药物在临床中最常用，但由于全身用药，其副作用控制及靶向性均不令人满意。.研究内容：1、通过不同浓度的槟榔碱饮水法建立小鼠口腔黏膜下纤维化模型，对动物喂食前后的口腔解剖学、生理学参数的检测，建立稳定，可靠的口腔黏膜下纤维化动物模型。.2、构建phVEGF165 腺病毒，并通过实验，获得稳定的大规模获取、提纯腺病毒的方法。.3、小鼠成纤维细胞分离、培养、纯化，鉴定及转染验证。.4、基因转染实验，获得稳定的口腔黏膜下纤维化动物转染方法，并用检测phVEGF165基因和蛋白表达，进行转染前后的比较，以确定转染是否成功。.5、进行转染前后的组织内血管参数比较，评价转染对缺血区血管生成的作用，探讨今后应用于临床的可能性。.重要结果及数据：1、采用浓度为1000mg/L槟榔碱饮水法可快速诱导出Balb/c小鼠典型、稳定的OSF模型。.2、小鼠OSF的血管以萎缩、减少为主，口腔癌小鼠癌变区域则表现出逐渐增加的趋势。OSF小鼠胶原过量堆积以成熟型的I 型胶原增加为主,辅以幼稚型的III型胶原增加。.3、AD-EGFP-VEGF165腺病毒转染小鼠成纤维细胞72h后，转染效率最高。.4、腺病毒注射OSF小鼠颊黏膜下组织6天后，可见VEGF阳性表达，而对照组未见阳性表达。微血管计数显示血管数量较对照组以及转染前明显增加。.科学意义：1、通过浓度为1000mg/L的槟榔碱饮水法可以建立稳定，可靠的口腔黏膜下纤维化动物模型，并获得稳定、成熟的监测方法。.2、人OSF后期血管增加考虑为OSF恶变，通过检测OSF的微血管变化，也许可以作为检测OSF癌变趋势的重要指标。.3、AD-EGFP-VEGF165腺病毒转染OSF小鼠后，可有效提高VEGF分泌水平，加速病变区新血管形成和侧枝循环的建立，改善口腔黏膜区局部供血、供氧，为将来可能应用于临床打下坚实的基础。