Drp1在脑外伤后线粒体损伤中的作用及其与自噬相互调节的相关机制研究

Acute membrane damage due to traumatic brain injury (TBI) is a critical precipitating event that leads to nerve cell death and neurological dysfunction. TBI-induced mitochondrial membrane damage that leads to secondary cell death has been extensively studied, and autophagy activation induced by TBI has also been proven. However, whether the nerve cells which meet acute mitochondrial damage could be repaired, whether mutual regulation between mitochondrial damage and autophagy exists, and the effects on nerve cell death and neurological dysfunction, together with other issues after TBI are still unknown. Base on many years that we study the nerve cell death and autophagy mechanism, this project was to establish TBI model (in vivo and in vitro) and base on a newly discovered regulatory protein Drp1 as a target that mediated mitochondria fission to study the issues as follows: ①to prove Drp1 involved in the process of mitochondria damage in nerve cells; ②using Drp1 inhibitor mdivi-1 or RNA interference, to study the effects of Drp1-mediated mitochondria fission on nerve cell damage in vivo and in vitro after TBI, and its mechanism; ③to study the effects of Drp1 on the flow of autophagy after TBI, and the effects of autophagy inhibition on Drp1 expression, mitochondrial morphology and nerve cell damage. The study will ultimately prove that, to inhibit Drp1-mediated mitochondrial damage and to regulate autophagy flow effectively are an important target for clinical treatment of TBI.

脑外伤（TBI）后继发性损害是造成神经细胞死亡和神经功能障碍的主要原因。TBI引起线粒体膜破坏导致继发性细胞死亡已被深入研究，TBI引起自噬激活也已被证明，但急性线粒体损伤的神经细胞是否可修复、线粒体损伤与自噬激活是否存在相互调节及其对TBI后细胞死亡及神经功能障碍的作用等问题仍未知。本项目在我们多年研究TBI后神经细胞死亡及自噬机制的基础上，分别建立体内和体外TBI模型，以最新发现的能够介导线粒体裂解过程的Drp1作为靶点，研究如下：①证明Drp1参与了TBI后神经细胞内线粒体的损害过程；②运用Drp1抑制剂mdivi-1或RNA干扰技术，在体内和体外分别研究Drp1在TBI后神经细胞损伤中的作用及机制；③研究Drp1对TBI后自噬流的影响以及抑制自噬对Drp1表达、线粒体形态及神经细胞损伤的影响。上述研究最终将证明抑制Drp1介导的线粒体损害并有效调节自噬流是临床治疗TBI的重要靶点。

线粒体融合和分裂的平衡是个重要的科学问题。Drp1是线粒体分裂的关键调控因子。然而Drp1在创伤性脑损伤（TBI）中的作用及分子机制尚未阐明。本课题采用Drp1的抑制剂Mdivi-1，探讨其在TBI诱导的细胞死亡和功能障碍中的作用以及潜在的分子机制。（1）研究了Drp1的蛋白质表达。（2）行为学与功能参数包括运动试验、Morris水迷宫、脑水肿、病变体积与血脑屏障等。（3）采用PI标记检测细胞死亡，透射电子显微镜评估线粒体形态。（4）研究了凋亡相关蛋白细胞色素c（cyt-c）和caspase-3的表达。（5） Mdivi-1在TBI后自噬和线粒体自噬的作用机制中的作用。（6）在原代神经元损伤模型中，探讨了Mdivi-1对细胞死亡、线粒体膜电位、ROS、ATP的作用。（7）在体外探讨了Mdivi-1对自噬流的影响。结果表明：（1）Drp1表达于TBI后1小时开始，在24小时达到高峰，但Mdivi-1抑制Drp1的上调。（2）Mdivi-1减轻了TBI引起的运动功能、学习记忆功能障碍。（3）Mdivi-1减轻脑水肿、减少线粒体的形态改变、TBI诱导的细胞死亡与损伤体体积。（4）Mdivi-1处理后减轻TBI诱导的BBB破坏和MMP-9表达上调受到抑制。（5）用Mdivi-1处理明显抑制TBI诱导的cyt-c从线粒体释放到细胞质中，及caspase-3激活。（6）在体内模型中，还发现自噬体在TBI后24小时在皮质神经元中积累，LC3的表达上调和p62下调表明自噬增强，而Mdivi-1扭转了这种改变。（7）Mdivi-1也减轻了细胞中LC3斑点和TUNEL阳性结构的数量，表明自噬可能参与了Mdivi-1的抗凋亡作用。（8）TBI诱导的PINK1-Parkin介导的线粒体自噬激活均被Mdivi-1抑制。（9）体外模型中：Mdivi-1缓解了损伤诱导的细胞死亡、线粒体膜电位损失、活性氧（ROS）产生和ATP减少。（10）溶酶体抑制剂氯喹（CQ）消除了Mdivi-1诱导的自噬体积累和细胞死亡的减少。结论：抑制Drp1可以通过维持正常的线粒体形态和抑制细胞凋亡的激活来帮助减轻TBI诱导的功能结果和细胞死亡。Mdivi-1至少部分通过抑制自噬功能障碍和线粒体自噬活化的机制来减轻TBI诱导的BBB破坏和细胞死亡。