Notch信号通路诱导分化治疗肝干细胞恶性转化的机制研究

There are two most recognized mechanisms for liver cancer stem cells (LCSCs) genesis: dedifferentiate from mature hepatocytes or malignant transformation of liver normal stem cells(LNSCs). Differentiation-inducing therapy is directed against these two theories. In order to explore some possible molecular mechanisms, we isolated and purified both LCSCs and LNSCs using our established method, and proved that Notch inhibition may promote LNSCs to differentiate into hepatocytes. Although LNSCs and LCSCs share similar and complicated mechanism of regulation, Notch is the core molecule in both LNSCs and LCSCs differentiation. The positive feedback between Notch and Hippo signaling pathway is the decisive factor in stem cell differentiation. The detailed molecular mechanism of Notch in the differentiation-inducing therapy targeted malignant transformation of LNSCs is still unclear. This project will follow the preliminary findings, to further confirm the role of Notch in the differentiation-inducing therapy targeted malignant transformation of LNSCs, explore the molecular mechanisms of crosstalk between Notch and Hippo signaling pathway, and eventually find downstream molecular mechanisms of Notch and Hippo in the differentiation-inducing therapy. Through these researches, it will not only expand the knowledges of activation of Notch and Hippo related molecular mechanisms, but also provide novel targets for differentiation-inducing therapy.

最近研究表明，肝癌干细胞的起源有两种理论：成熟肝细胞去分化和正常肝干/祖细胞分化受阻。针对这两种理论，研究者提出诱导分化治疗策略。我们利用前期建立的干细胞分离、纯化方法，分别富集了肝干细胞和肝癌干细胞，并证实Notch抑制剂能诱导肝干细胞定向分化为正常肝细胞。尽管肝干细胞和肝癌干细胞具有诸多类似的生物学调控机制，但是Notch通路在肝癌干细胞中的作用更加复杂，常与其它分子形成网路，其中Notch与Hippo通路的正反馈调节环路对干细胞的分化起到关键作用。然而，基于肝癌干细胞起源的理论，利用Notch针对肝癌干细胞进行诱导分化治疗的研究鲜有报道。本项目拟在干细胞水平首先确认Notch信号通路对肝干细胞恶性转化的诱导分化治疗效果，并利用Notch与Hippo信号间串话通讯，研究肝癌干细胞的诱导分化治疗策略，进一步明确下游分子，为肝癌干细胞的诱导分化治疗提供新的干预靶点。

背景：肝细胞肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，具有高度的侵袭性、复发率和耐药性。肝癌干细胞理论给这些现象一个合理的解释。肝癌干细胞的起源主要有两种理论：1、肝癌干细由成熟的肝细胞去分化所导致；2、肝正常干细胞的分化受阻滞所引起（lnscs）。诱导分化治疗可以同时针对这两种理论进行治疗。我们前期研究发现Notch信号通路在肝细胞分化和抗肿瘤中发挥着重要作用。在前期的实验过程中，我们已经构建了肝干细胞恶性转化的细胞模型，本课题试图说明抑制Notch信号通路在不仅能逆转肝细胞恶性转化，而且这种逆转作用是通过诱导分化来实现的。.内容及方法：本研究通过在肝干细胞中过表达癌基因HOTAIR，构建了肝干细胞恶性转化的细胞模型，进一步通过Notch信号通路抑制剂下调Notch信号的表达后采用MTT法检测细胞增殖状态、免疫印迹法检测细胞周期蛋白的表达变化情况、通过体外实验和划痕实验检测了细胞侵袭和迁移能力的变化、在分子学和功能学水平上检测了成熟肝细胞的标志物、不成熟肝细胞的标志物以及白蛋白、尿素、糖原合成功能及排泌吲哚青绿的功能，最后我们通过检测EMT过程关键分子E-cadherin和β-catenin的表达变化情况。.研究结果：通过上述实验我们得到了以下主要结果，首先，抑制Notch信号通路能翻转肝干细胞恶性转化后的高增殖状态；其次，抑制Notch信号通路能降低肝干细胞恶性转化后的高侵袭状态；第三，抑制Notch信号通路诱导分化能使恶性转化的肝干细胞获得成熟肝细胞表型；最后，抑制Notch信号通路诱导分化能使恶性转化向正常肝细胞分化的可能机制是通过调节EMT过程来实现的。.结论及科学意义：在这项研究中，我们发现抑制Notch信号通路能有效的发挥抗肿瘤效应，而这种抗肿瘤作用不仅在于其能直接杀死肝癌细胞/肝癌干细胞，同时能诱导肝癌干细胞分化为成熟的肝细胞，从而改善和降低的肝癌的恶性程度。究其可能的分子机制，是通过逆转肿瘤发生过程中的EMT过程，使其向MET过程发展来实现的。这一发现为抗肿瘤治疗提供了新的思路，同时为肿瘤新药物的研发提供了新的思路。