巢蛋白对非小细胞肺癌细胞增殖的作用及相关调控机制的研究

申请人前期研究发现神经干细胞标记蛋白-巢蛋白(nestin)表达强度与非小细胞肺癌恶性程度、淋巴结转移、淋巴管及血管新生密切相关，提示nestin可能在非小细胞肺癌细胞增殖及转移过程中发挥作用，但是缺乏细胞和分子机制等方面的直接证据。申请人利用RNA干扰技术，获得了nestin表达下调的非小细胞肺癌细胞株，发现nestin表达下调抑制A549细胞增殖，细胞周期停滞。因此，本项目拟进一步通过体内实验探讨nestin对非小细胞肺癌细胞增殖的影响，并利用Western Blot和IP等技术重点研究nestin调控Akt-GSK3beta-Rb蛋白信号通路致使细胞增殖抑制和细胞周期阻滞的分子机制，从而获得全面、详细、直接的nestin调控非小细胞肺癌证据，为明确nestin在非小细胞肺癌中的功能，并将其确定为非小细胞肺癌诊断、治疗和判断预后的新标志物提供理论支持。

本研究利用巢蛋白（nestin）表达下调的非小细胞肺癌细胞株作为模型，在细胞、分子水平观察nestin对非小细胞肺癌增殖影响及调控分子机制。此外，还探讨了nestin 在食管鳞癌病例中的临床意义和作用。.通过逆转录病毒和Puromycin药物筛选，建立nestin表达下调的A549、H460和H1299细胞株。在体外利用细胞克隆形成实验、CCK-8检测试剂盒和增殖抗原Ki-67荧光染色来观察nestin干扰组和对照组细胞增殖变化。实验结果表明nestin干扰组细胞增殖能力明显减弱，获得nestin影响非小细胞肺癌细胞增殖的体外证据。.利用EdU检测试剂盒和流式细胞仪分析细胞周期，发现nestin干扰组细胞DNA合成减少，细胞周期中S期细胞数量明显减少。进一步检测细胞周期相关蛋白表达，显示磷酸化Rb蛋白在nestin干扰组中表达减少。同时通过蛋白印迹实验检测增殖相关蛋白表达，结果表明磷酸化Akt和磷酸化GSK3α/β的表达也明显减少，提示nestin通过AKt-GSK3β-Rb信号通路调控细胞增殖。.此外，开展nestin在食管鳞癌中作用的研究。食管鳞癌病理标本和细胞株TE-1、Eca-109都表达nestin。结合93例食管鳞癌患者临床资料，发现nestin表达阳性患者中位生存时间（MST）和无进展生存时间（PFS）明显短于nestin表达阴性组患者（P=0.023；P=0.005）。并且，食管鳞癌病理标本组化染色表明nestin表达水平与Ki67、PCNA、CDK5和p35表达水平具有明显相关性（P＜0.05），提示nestin 在食管鳞癌细胞增殖或凋亡中发挥作用。