双组份调控蛋白Rv3133c(DosR)调控结核分枝杆菌精氨酸合成的机制研究

The two-component transcription regulator protein Rv3133c (DosR) of Mycobacterium tuberculosis plays a key role in biosynthesis and energy metabolism when Mtb enters dormancy state. Therefore, it is important to decipher the regulation mechanism of DosR. In previous study, we found the gene expression level of arginine biosynthesis cluster raise and concentration of arginine in lysis solution increase when supplemented with VC, meanwhile, growth rate of BCG is inhibited significantly. Morever, rv1652，the first gene in arginine biosynthesis cluster，interacts with DosR and some of small molecules inhibit their interaction, which indicates that DosR regulates arginine biosynthesis and is impacted by certain small molecules. However, the regulation mechanism of DosR to arginine biosynthesis is not clear. In this study, we will carry out ChIP-seq, EMSA and footprinting experiments et al to study the interaction characteristics between DosR and rv1652 promoter region. Structural Biology will be applied to decipher the regulation mechanism of novel small molecules which impact DosR and rv1652 promoter interaction. The physiological function of DosR will be further investigated with animal model in vivo using gene knockout strain. In all, the understanding of transcription regulation mechanism of DosR will strongly support the tuberculosis drug development and prevention in the future.

双组份调控蛋白Rv3133c（DosR）在结核分枝杆菌（Mtb）进入休眠期的生物合成、能量代谢等过程中起关键的调控作用，因此解析DosR调控机制意义重大。前期研究发现，BCG培养过程中添加Vc后，其精氨酸合成基因簇的所有基因表达上调，裂解液中精氨酸浓度显著增高，BCG生长速度受到明显抑制；而DosR与精氨酸合成基因簇中第一个基因rv1652的启动子相结合，且这种结合可被小分子物质所抑制，提示DosR调控精氨酸的合成并受到小分子物质影响，但其详细调控机制不明。本项目拟应用ChIP-seq、EMSA和足迹实验等技术，解析DosR蛋白与rv1652启动子的互作特点，通过结构生物学研究小分子抑制DosR与rv1652互作的机制，利用基因敲除和动物感染实验进一步验证DosR的调控功能，阐明DosR调控精氨酸的合成机制，从而为结核病预防和药物开发奠定理论基础。

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起，并在全世界范围内危害人类健康的重要疾病之一。该病原菌能在宿主体内长期休眠，最主要的是依赖调控蛋白快速适应环境变化进而长期持留。其中双组份调控系统 DosRST中的DosR调控蛋白能够调控48个基因的表达，这些变化的基因主要集中在氨基酸合成、脂类代谢、DNA损伤修复、糖类代谢等多种生理过程。我们前期研究发现，在培养BCG过程中添加Vc能够导致精氨酸合成途径中的相关基因表达上调，而精氨酸合成相关基因对MTB的生长是必须的。因此，本项目在分子水平上解析DosR在调控精氨酸合成中的潜在调控作用，为结核病的药物靶标筛选提供理论支撑。.本研究通过体外凝胶阻滞实验确定未磷酸的DosR和磷酸化后DosR(P-DosR)均可以与精氨酸合成基因簇基因argC 的启动子发生特异性结合。足迹实验结果表明，DosR 在 argC 启动子上具有两段结合区域，这两段结合序列能够形成不连续的反向的互补结构。ChIP 实验证实DosR 在细菌体内可与argC 启动子结合，证实 DosR 在体外以及体内条件下对于精氨酸合成均具有调控作用。辅助因子精氨酸、谷氨酰胺以及赖氨酸等可抑制 DosR 以及 P-DosR与 argC 启动子的结合，VB6、Vc、胆碱、Fe3+以及Cu2+可抑制DosR与argC启动子的结合，而Co2+促进二者结合。分子对接实验及EMSA 试验证实DosR 蛋白的 Asn-167以及 Val-181 氨基酸残基对于DosR蛋白与辅助分子的相互作用至关重要。我们通过同源重组的方法构建了BCGΔdosR 缺失株，并采用转录组学以及蛋白组学方法分析缺失株与野生株在基因水平以及蛋白表达水平上的差异，结果显示dosR 基因的缺失导致104个基因的转录水平发生明显改变，99个转录水平下调，5个基因上调。序列保守性分析确定C7以及G12对argC 启动子与DosR互作非常关键。BCGΔdosR缺失株中179个蛋白的表达水平发生改变，这些蛋白在结核分枝杆菌的毒力、金属离子代谢等方面发挥重要作用。我们的研究表明DosR在结核分枝杆菌精氨酸合成过程中扮演重要角色，为全面解析结核分枝杆菌的适应机制提供理论基础。