自噬在镉致大鼠大脑皮质神经细胞毒性中的作用及调控机理

Cadmium is a severely toxic heavy metal. It is reported that low concentrations of cadmium brought about neurotoxicity to cerebral cortical neuron. Applicant and co-workers have found that cadmium induced not only the development of apoptosis, but also the development of autophagy to rat's cerebral cortical neuron. The detailed mechanism is still unclear. This study bases on the established methods of rat's cerebral cortical neuron cultivation in vitro. Different concentrations of cadmium (0, 1, 2.5, 5, 10μM), and specific inhibitor (3-MA) as well as accelerator (rapamycin) of autophagy will be added into the cell culture. The proliferation, activity, and growth of the cells will be observed by xCelligence System. The percentage of apoptosis, and LC3 which is regarded as the marker of autophagosome will be assayed. The ultrastructure of autophagosome, fluorescent fusion protein of LC3, and the structre of autophagolysosome and acidic vesicular organelles will be observed. The expressions of genes (ULK1/Atg1、Atg13、Atg17、Atg101 and the other like) which induce the development of autophagy, and genes (Beclin-1、PI3K-Ⅲ、mTOR、Atg12、Atg3、Atg5 etc.) which associate the formation of autophagosome will be further determined. In regard to cadmium-induced toxicity on rat's cerebral cortical neuron, the aim of this study is to ascertain the role of autophagy，the critical regulatory genes and signaling pathways.

镉是具有很强毒性的重金属，低浓度的镉就具有神经毒性，不仅诱导细胞凋亡，申请者还发现可诱导大鼠大脑皮质神经细胞发生自噬，其作用和调控机理仍不清楚。本项目是在建立体外大鼠大脑皮质神经细胞培养的基础上，用不同浓度（0、1、2.5、5、10μM）的镉处理，同时添加特异性自噬抑制剂（3-MA）或促进剂（rapamycin），在细胞培养过程中通过实时细胞分析系统观测细胞增殖、活性与生长特性的动态变化，检测细胞凋亡率和自噬体标志物LC3的表达，观察自噬体超微结构、LC3荧光融合蛋白、自噬溶酶体和酸性泡状细胞器结构；进一步检测自噬诱导相关基因（ULK1/Atg1、Atg13、Atg17、Atg101等）和自噬体形成相关基因（Beclin-1、PI3K-Ⅲ、mTOR、Atg12、Atg3、Atg5等）蛋白的表达。确定自噬在镉致大鼠大脑皮质神经细胞毒性中的作用，阐明其主要的调控基因及机理。

在建立体外大鼠大脑皮质神经细胞培养的基础上，用不同浓度（0、1、2.5、5、10、20μM）的Cd处理细胞不同时间，同时添加特异性自噬抑制剂（3-MA）或促进剂（rapamycin），在细胞培养过程中通过实时细胞分析系统观测细胞增殖、活性与生长特性的动态变化，检测细胞凋亡率和自噬体标志物LC3的表达，观察自噬体超微结构、LC3荧光融合蛋白、自噬溶酶体和酸性泡状细胞器结构；进一步检测自噬诱导相关基因和自噬体形成相关基因蛋白的表达，研究了自噬与线粒体损伤的关系，确定自噬在Cd致大鼠大脑皮质神经细胞毒性中的作用，阐明其主要的调控基因及机理。结果表明，（1）随着镉浓度的增加和时间的延长，细胞活性明显降低，在一定的浓度和时间范围内，呈现明显的剂量依赖和时间依赖效应；LC3-II蛋白表达量显著上升，酸性自噬泡形成，出现典型的自噬体，胞质空泡化。说明镉对神经细胞具有明显的毒性作用，可以诱导神经细胞发生自噬和凋亡。抑制自噬，神经细胞对镉的耐受降低，激活自噬，神经细胞的耐受性增加，提示自噬是神经细胞抵御镉应激的重要的保护机制。（2）20 μmol/L 镉处理细胞不同时间后，Beclin-1和PI3K-III的表达呈现先升高后降低的趋势， LY294002显著抑制了Beclin-1、PI3K-III蛋白的表达，同时明显抑制LC3-II的表达水平及LC3聚点。说明PI3K -III/Beclin-1/Bcl-2通路在镉诱导的自噬中起正调控作用。而自噬相关蛋白Atg5，Atg7等的表达水平变化，说明存在非PI3K-III -Beclin-1依赖途径的自噬。（3）与对照组相比，镉处理细胞12 h后乙酰化tubulin的表达水平以及tau磷酸化水平均极显著降低，微管数量明显减少，自噬相关蛋白LC3-II，Atg5的蛋白表达量降低，线粒体膜电位、细胞中ATP 含量明显下降，提示镉引起的细胞微管损伤能够影响自噬水平进而导致线粒体损伤。而镉与紫杉醇共处理组上述变化得以显著缓解，线粒体空泡化现象明显减轻。表明紫杉醇通过保护细胞微管升高了细胞的自噬水平，微管依赖性自噬在镉引起的大鼠大脑皮质神经细胞线粒体损伤中具有一定的保护作用。