PI3K/Akt信号通路在DHEA衍生物抗EV71中的作用研究

Enterovirus 71 (EV71) is one of the most notable causative agent of HFMD, there is currently no vaccine or specific drugs for EV71 infections. Dehydroepiandrosterone (DHEA) is a steroidal compound produced by the human adrenal cortex. In our previous results, we observed that DHEA can inhibit EV71 infection to a certain degree, subsequently we synthesized a series of DHEA analogues based on structural of DHEA. We found that the compounds W-3 and W-13 have high potency aginst EV71 and low side-effect. Many studies showed that PI3K/Akt signaling cascade plays a role during DHEA treatment in EV71 infection. Our preliminary experiment demonstrated that the activation of AKT induced by EV71 infection could be attenuated by W-3 and W-13. Based on our previous work, we try to realize the following goals in this study: identifying the target viral proteins of DHEA analogs against EV71 infection; recognizing the involved viral proteins that plays the key role in the activation of PI3K/Akt pathway；exploring the molecular mechanism of anti-EV71 activity of W-3 and W-13 including the role of PI3K/Akt signaling cascade. All these studies can provide a theoretical basis for the development of anti-EV71 drugs with high potency and excellent properties.

肠道病毒71型（EV71）是引起手足口病的最主要病原体之一，目前对于EV71感染无疫苗或特异药物。去氢表雄酮（DHEA）是人体肾上腺皮质分泌的甾体类化合物。我们在前期工作中，发现DHEA具有一定程度的抗EV71活性，且以DHEA为母体进行结构改造合成了一系列DHEA类似物，从中筛选到极其高效、低毒的抑制EV71的化合物W-3和W-13。 众多研究表明EV71感染、DHEA发挥多种生物学效应均和PI3K/Akt信号通路有关，经预试验确认W-3和W-13可以抑制EV71感染细胞中Akt的激活。本项目在前期工作的基础上，拟确认W-3和W-13抑制EV71的作用靶点；确定在激活PI3K/Akt通路中起主要作用的病毒蛋白；阐明W-3和W-13对PI3K/Akt通路的调控来发挥抗EV71作用的分子机制，为进一步开发高效优良的抗EV71药物提供理论支持。

本项目以DHEA为母体合成了DHEA衍生物W-3和W-13，确认其具有极强的抗病毒活性，药效学性能优良。对其抗EV71机理开展研究，发现该类化合物不仅对EV71感染具有预防作用，还可抑制病毒吸附内化，而对于病毒生物合成表现出最强的抑制效果。进一步研究发现，DHEA衍生物不是针对病毒本身发挥作用，即既不能完全抑制病毒蛋白的合成，也不能抑制病毒增殖中必须的关键蛋白酶的活性。可见该类化合物最有可能通过影响宿主细胞内环境来发挥抗EV71的作用。.进一步采用转录组测序的方法，确认DHEA衍生物影响细胞内的信号通路网络。我们的研究证实PI3K/Akt信号通路成员AKT、PTEN、GSK3β、MDM2、FOXO、p53、CCND1、TSC1、RHEB等基因在EV71感染后，转录组水平上无明显变化差异，W-13处理也无明显影响。由此表明PI3K/Akt信号通路在DHEA衍生物抑制EV71感染中未起到核心调控作用。其次，在对三组样品（RD细胞对照组、EV71感染组和W-13处理的病毒感染组）转录组测序结果基因相关性的分析中发现，EV71感染组相对于RD细胞对照组表现出大的基因表达差异，而W-13处理组的基因表达谱则更接近于未感染EV71的RD细胞对照组，充分说明化合物处理回复了众多EV71感染引发的基因表达变化，由此表现出强的抗EV71效力。GO功能显著性富集分析结果表明具有转录调控活性、核酸连接转录因子功能的基因，有可能是化合物呈现极强抗病毒活性的调控靶标。差异基因的Pathway显著性富集分析结果显示PPAR、MAPK及mTOR信号通路可能与DHEA衍生物抑制EV71感染相关。挑选代表性基因进行qRT-PCR转录水平验证，结果表明大多数基因的上下调结果保持一致，但有的基因在上下调倍数存在一定的差异。与P13K/Akt信号通路密切相关的TXNIP和RN7SL基因的表达在EV71感染后分别上调和下调约3倍，这与转录组测序结果基本一致，而W3和W13几乎可以逆转这两种基因的表达，由此对病毒感染的RD细胞起到完全的保护作用。说明TXNIP和RN7SL基因对DHEA衍生物抑制EV71感染起到重要的调控作用。.该研究为类固醇类化合物抗病毒机理研究提供了一定的借鉴，为抗病毒药物开发提供了新的靶点，同时为EV71感染机制提供了新的信息。