基于心主血脉构建斑马鱼慢性心衰心气虚病证动物模型

Heart qi deficiency syndrome (HQDS) is the basic syndrome of chronic heart failure (HF). Heart dominating blood and vessel is the theoretical basis of chronic HF and HQDS animal model. As a novel diease model system, zebrafish has the advantage of transparent embryo body to visualize the morphology of the heart, blood cell, blood vessels and other organs in life directly. Moreover, one pair of fish can lay more than hundreds of embryos. This make zebrafish an proper model for HQDS and heart dominating blood vessels study. In this study, we will use the transgenic zebrafish lines, such as cmlc2:eGFP which labels the heart with green flourescent protein (GFP), and use isoproterenol and forced swimming technology to establish an zebrafish model for chronic HF and HQDS. Real-time lapse movie will be taken to record and evaluate the heart beating and morphology changes. We will also use transmission electron microscope (TEM), laser scanning confocal microscope, immunofluorescent staining to observe changes of cardiac function, myocardial remodeling, neuroendocrine and related gene expression variations. The successful establishment of the chronic HF and HQDS zebrafish model will be widely used in HQDS study and drug screening. Also it will improve the treatment efficiency of traditional chinese medicine in HF.

心气虚证是慢性心衰临床常见基础证型之一。"心主血脉"是目前构建慢性心衰心气虚病证动物模型的理论基础。斑马鱼身体透明，产卵量大，可实时动态观察心、血、脉的结构、形态及其相互影响，是探索"心主血脉"和模拟慢性心衰心气虚病证的良好选择。本课题拟借助心脏及血管内皮细胞表达绿色且红细胞表达红色荧光蛋白的转基因品系斑马鱼，利用异丙肾上腺素药浴和摇床强迫游泳等技术构建斑马鱼慢性心衰心气虚病证模型，通过显微成像技术拍摄心脏搏动高速高清视频，实时记录心脏、血管、血液的变化；通过视频分析软件间接评价其心功能；运用激光共聚焦、免疫荧光等观察心脏重构和心肌结构改变；同时检测与斑马鱼心脏功能相关生化标志物的表达水平的变化，从心功能、心肌重构和神经内分泌等方面系统评价该模型。该模型的成功建立将为心衰心气虚病证的基础研究、药物筛选等奠定前期实验基础。

心气虚证是慢性心衰临床常见基础证型之一。“心主血脉”是目前构建慢性心衰心气虚病证动物模型的理论基础。斑马鱼身体透明，产卵量大，可实时动态观察心、血、脉的结构、形态及其相互影响，是探索“心主血脉”和模拟慢性心衰心气虚病证的良好选择。该模型成功后可进行高效、经济的大样本实验研究，对心血管疾病相关的中药活性成分进行高通量筛选，深入研究慢性心衰的病理机制，可为慢性心衰心气虚病证的临床治疗提供依据。本课题组通过用ISO药浴斑马鱼构建斑马鱼慢性心衰心气虚病证模型；运用视频分析法间接测量斑马鱼的心功能指标，评价该模型的心功能变化情况；通过免疫荧光技术检测心肌细胞形态和凋亡，通过合成地高辛标记的斑马鱼心肌肌钙蛋白基因（cardiac troponin T type 2a, tnnt2a）反义RNA探针，运用斑马鱼整体原位杂交技术进行tnnt2a的表达定位，双标准曲线相对定量qPCR法检测tnnt2a 的表达水平。通过图片、视频多软件相结合，摸索出一套适合测量斑马鱼心功能的方法。运用倒置显微镜（OLYMPUS, BX51, DP Controller: 3.1.1.267）拍摄斑马鱼心室搏动视频，再经Adobe Premiere CS3、Image J等软件解析，最终计算斑马鱼舒张期心室短径（ad）、长径（bd）及表面积（Sd），收缩期心室短径（as）、长径（bs）及表面积（Ss）。再根据公式计算心室短轴缩短率（fractional shortening of ventricle long axis, FSS）、心室长轴缩短率（fractional shortening of ventricle long axis, FSL）及心室表面积改变率（fractional area change of ventricle, FAC）三个心功能指标。最终我们的课题数据表明我们构建的心衰模型心功能下降。通过运用原位杂交和qPCR对肌钙蛋白tnnt2a的时空表达进行研究发现，斑马鱼慢性心衰心气虚病证模型tnnt2a表达上调，且特异表达于斑马鱼心脏，心室表达量高于心房。该模型将为心衰心气虚病证的基础研究、药物筛选等奠定前期实验基础，不断提高中医药防治心衰疗效。