定向自组装拟蛛丝蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达及其力学性能研究

Due to its special sequence structure, spider silk protein has unique physical and chemical properties, mechanical properties and excellent biological properties. With the expansion of the application value of spider silk in many fields as a functional material, progress has been made in the studies on the expression of recombinants spider silk proteins through many host systems by gene recombinant techniques. However, the mechanical properties of the silk fiber spun with the recombinant spider silk proteins expressed by traditional methods is still unsatisfactory because of the defects that the molecular weight of the expressed recombinant spider silk proteins is too small and does not have the molecular orientation. The project intends to express a quasi spider silk protein composed of spider silk protein and synthetic collagen using Pichia pastoris expression system. The quasi spider silk protein is a kind of "ABA-type" triblock copolymer. The triple helix-forming A blocks at both ends of the triblock copolymers consist of (Pro-Gly-Pro)n homopolymeric stretches, and the middle section of the molecule (B section) consists of spider silk protein which has been designed optimally. The characteristics of the three block copolymer forming supramolecular by directed self-assembly ensure that artificial spider silk fibers will meet their requirement for molecular weight and certain molecular orientation to promote the formation of silk fibers. In view of the huge potential of the spider silk protein in the fields of military and medical engineering, we hope that this project will make contributions to the study of military and medical engineering of our country.

蛛丝蛋白特殊的序列结构使其具有独特的理化性能、力学性能和优良的生物学性能。随着蜘蛛丝在多领域功能性材料应用价值的发掘，采用基因重组技术，利用多种宿主表达重组蛛丝蛋白的研究获得一定进展，但传统方法表达的重组蛛丝蛋白存在分子量偏小、不具有分子取向等缺陷，造成所纺丝纤维的力学性能差强人意。本项目拟利用巴氏毕赤酵母系统表达一种由蛛丝蛋白和类胶原蛋白融合构成的拟蛛丝蛋白，其为"ABA型"三嵌段共聚物，两端（A段）为(Pro-Gly-Pro)n同聚体延伸段，可定向形成胶原蛋白三螺旋结构，中间（B段）为优化设计的蛛丝蛋白。利用三嵌段共聚物定向自组装形成超分子的特性，确保人工蛛丝纤维对分子量的要求，也赋予拟蛛丝蛋白确定的分子取向，促进丝纤维的形成。鉴于蛛丝蛋白在军事及医学工程等领域的巨大应用潜力，冀望此项目能够为我国的军事及医学工程等领域的研究做出一定的贡献。

蛛丝蛋白特殊的序列结构使其具有独特的理化性能、力学性能和优良的生物学性能。随着蜘蛛丝在多领域功能性材料应用价值的发掘，采用基因重组技术，利用多种宿主表达重组蛛丝蛋白的研究获得一定进展，但传统方法表达的重组蛛丝蛋白存在分子量偏小、不具有分子取向等缺陷，造成所纺丝纤维的力学性能差强人意。本项目拟表达一种由蛛丝蛋白和类胶原蛋白融合构成的拟蛛丝蛋白，其为“ABA型”三嵌段共聚物，两端（A段）为(Pro-Gly-Pro)n同聚体延伸段，可定向形成胶原蛋白三螺旋结构，中间（B段）为优化设计的蛛丝蛋白。利用三嵌段共聚物定向自组装形成超分子的特性，确保人工蛛丝纤维对分子量的要求，也赋予拟蛛丝蛋白确定的分子取向，促进丝纤维的形成。鉴于蛛丝蛋白在军事及医学工程等领域的巨大应用潜力，冀望此项目能够为医学工程等领域的研究做出一定的贡献。. 在项目执行时，首先利用了巴氏毕赤酵母对拟蛛丝蛋白进行表达。构建了5株巴氏毕赤酵母基因工程菌，只有一株菌能够完整表达目的蛋白，但所表达的目的蛋白的分子量只有29975. 27Da，其他菌株未能完整表达目的蛋白。之后采用原核表达系统来表达拟蛛丝蛋白。最终获得一株可表达目的蛋白的大肠杆菌基因工程菌，经质谱鉴定，确定其分子量为52032.46Da，达到对分子量的预期要求。红外光谱、圆二色谱和扫描电子显微镜表明，重组的拟蛛丝蛋白具有与天然蜘蛛丝蛋白相似的结构特征，因此，对该蛋白结构的表征表明，该蛋白具有作为生物医学材料的潜力。然而，后续的湿纺纤维实验的结果却不尽如人意。因此，需要进一步研究，寻找更好的成纤维技术，以实现该拟蛛丝蛋白在生物医学工程领域的应用。.