CXCL4多肽拮抗剂筛选及其对移植肝慢性失功的防治作用研究

慢性移植肝失功是导致移植物丢失并威胁受者生命的重要原因，其主要病理表现为肝纤维化，预防或逆转移植肝纤维化是防治其慢性失功的重要措施。血小板衍生因子4（CXCL4）参与了肝窦内皮细胞、肝星状细胞向肌成纤维母细胞（MFB）的"转分化"和肝纤维化，是抗移植肝纤维化治疗良好的特异靶点。肝窦内皮细胞、肝星状细胞膜存在着CXCL4特异受体，但其与受体结合的氨基酸顺序并不清楚。本课题将探讨CXCL4参与移植肝慢性失功的相关机制，并利用噬菌体表面展示技术，以高水平表达CXCL4的肝星状细胞作为靶细胞，寻找CXCL4与特异受体结合的小分子多肽序列；进一步证实该多肽可与CXCL4竞争性结合于膜受体，从而达到拮抗CXCL4的作用；并通过细胞实验和动物模型，验证该多肽可抑制肝星状细胞转分化和移植肝慢性纤维化进程。

背景：虽然器官移植技术的不断提高使肝移植的临床疗效有了明显的改善，但肝移植术后移植肝慢性失功（CLAD）的发生、发展仍然是限制其长期存活的重要因素。肝细胞坏死、肝动脉阻塞性改变、胆管消失、并最终形成肝纤维化是CLAD的病理特征。其发病机制仍然不清楚，更无有效治疗。近期研究文献提示：CXCL4作为一个低分子趋化因子，广泛参与了血管生成、纤维化、造血、有丝分裂、肿瘤的生长与转移、及免疫应答过程。因此。本研究的目的是探讨CXCL4在CLAD发病中的作用，并通过制备CXCL4多肽拮抗剂，验证其对CLAD的防治作用。.材料与方法：用体重约220g-250g的60只雄性DA大鼠作为供体，60只雄性Lewis大鼠作为受体复制CLAD模型。移植手术前利用构建的CXCL4 shRNA重组慢病毒载体感染供肝。随机实验分组为：单纯肝移植对照组(A组)、CXCL4 shRNA组(B组)、对照空载体组(C组)、FK506组(D组)、FK506+CXCL4 shRNA组(E组)、FK506+对照空载体组(F组)。利用该模型，探讨CXCL4在CLAD发病中的作用，并利用iTAQ蛋白组学分析技术初步研究该病理过程的发病机制。进而，以人类CXCL4 (PF4) 抗体为靶分子，利用噬菌体7肽文库（Ph.D 7）筛选出能与CXCL4特异性竞争性结合的噬菌体多肽序列。人工合成该多肽，并验证该小分子多肽对大鼠CLAD的防治作用。.结果：本研究成功构建了CXCL4 shRNA重组慢病毒载体。经组织学观察和肝功能检测，成功复制了DA(RT1a)→Lewis(RT11)大鼠CLAD模型。本研究发现CXCL4在慢性失功移植肝组织中呈高表达， iTaq蛋白组学分析显示：CXCL4通过EGF受体信号途径诱导PI3K, STAT3, STAT5B, COL1A1, COL1A2 等的表达。本研究利用Ph.D 7成功筛选出小分子多肽，命名为P7；并初步验证了P7可以改善移植肝功能和肝组织分级。.结论：CXCL4在CLAD发病中具有重要作用。CXCL4可能通过EGF受体信号途径诱导PI3K, STAT3, STAT5B, COL1A1, COL1A2 等的表达，参与了CLAD中的发病。本研究利用Ph.D 7成功筛选出小分子多肽P7，并证实P7对CLAD具有明显的防治作用。