脂肪来源干细胞复合EPCs和PRF对涎腺组织再生的实验研究

头颈肿瘤患者放疗后常导致其涎腺不可逆性损伤和唾液分泌功能障碍，引起口干症，说话、吞咽困难，继发猛性龋齿、口腔粘膜感染等。目前，传统的对症治疗尚无法治愈。随着组织工程技术的发展，为涎腺组织再生带来了希望。本项目针对涎腺再生的瓶颈问题，拟采用细胞共培养技术研究脂肪来源干细胞（ADSCs）转分化涎腺腺泡细胞的特点；研制可注射ADSCs与血管内皮前体细胞(EPCs)和富血小板纤维蛋白（PRF）的复合体；应用动物涎腺放射损伤模型研究ADSCs复合体对小鼠和小型猪涎腺再生的作用；分析ADSCs复合体体外分化特点及动物体内细胞分化、血管化生成特点和组织再生规律。利用EPCs和PRF的生物学特性改善ADSCs复合移植物成血管微环境，促进较大体积的人工涎腺血管化和腺泡的再生，重建涎腺分泌的功能。本研究的人工涎腺构建策略有望为涎腺再生提供安全有效的手段，对其他腺体组织或器官再生的研究亦将产生积极的影响。

头颈肿瘤患者放疗后常导致其涎腺不可逆性损伤和唾液分泌功能障碍，本项目探讨促进涎腺再生及恢复涎腺功能的可能性。本项目依据组织再生理论和组织工程技术探索放射损伤涎腺的再生修复。本项目主要开展了以下几方面的研究：1、探索小鼠涎腺上皮细胞体外培养的条件及其生物学特性，成功建立了小鼠涎腺上皮细胞系，为进行干细胞转分化研究奠定了基础；2、体外分离培养及建立了小鼠脂肪来源干细胞系（ADSCs），成功地应用微重力旋转生物系统扩大培养干细胞，为建立种子细胞库提供技术支撑；3、研究ADSCs干细胞分化潜能，诱导ADSCs分化为成骨细胞、成脂细胞、血管内皮前体细胞，并成功地进行了小鼠ADSCs转分化涎腺腺泡细胞，转分化效率达到49.84%，为进行应用ADSCs促进放射损伤涎腺再生修复提供实验依据；4、分离制备富血小板纤维蛋白（PRF），研究其生物学特性，扫描电镜显示PRF具有三维纤维网状结构，ELISA检测PRF能够释放多种生物因子，例如PDGF-BB、VEGF 等，将ADSCs与血管内皮前体细胞(EPCs)和PRF制备成复合体，可用于小鼠和小型猪涎腺再生实验研究；5、应用直线加速器在小鼠下颌下腺区给予18Gy照射或在小型猪腮腺区给予20Gy照射，3-4月后能导致小鼠或小型猪涎腺唾液分泌功能障碍，建立的动物放射损伤模型为涎腺再生研究奠定基础；6、研究DiI荧光素标记ADSCs或GFP荧光小鼠分离培养的ADSCs在小鼠体内归巢，结果表明，ADSCs能够随血流归巢到涎腺损伤区；7、18Gy照射小鼠下颌下腺区，即刻给予尾静脉注射ADSCs治疗8周，涎腺腺泡细胞凋亡减少，唾液流量恢复至正常水平60%，表明ADSCs有一定的预防涎腺放射损伤效应；8、制备ADSCs+PRF或ADSCs+PRF+EPCs复合体，建立小鼠涎腺放射损伤模型，在下颌下腺区局部注射复合体3周，治疗后3月，小鼠涎腺腺泡细胞凋亡数显著降低为10.6%（对照组53.6%），出现类似新生的腺泡，唾液流率显著增加78.37或87.25μl/min（对照组35.37μl /min）；9、制备ADSCs+PRF复合体，建立小型猪涎腺放射损伤模型，在腮腺区局部注射复合体18d，治疗后1月，腮腺组织中显示DiI标记ADSCs，治疗后8月，腮腺组织中凋亡细胞明显减少、腺泡数量明显增加，唾液流率显著增加至2.22ml/10min（对照组1