新型超声控释纳米靶向递送系统介导的心肌梗死区成纤维细胞直接重编程研究

Gene mediated in-situ direct reprogramming from fibroblasts in infarct myocardium is an emerging method for the treatment of myocardial infarction. However, lacking of the efficient gene targeted delivery methods made direct reprogramming still low effect. Previous studies demonstrated that UTMD is a targeted and efficient non-viral gene delivery technology. As a candidate of gene vector, MONs can load genes with high biocompatibility. This research intends to construct a novel gene delivery system combining UTMDs and MONs, which carried transcription factors (Gata4, Mef2c, Tbx5: GMT). After intravenous injection, GMT genes can be delivered into fibroblasts of infarct zone under ultrasonic irradiation, and reprogramed them into cardiomyocytes. This study aims to investigate a novel method to improve in situ direct reprogramming efficiency for cardiac repair and other gene therapy strategies.

基因介导的心肌梗死区成纤维细胞原位直接重编程是修复梗死心肌的新兴方法，但缺乏有效的梗死区成纤维细胞靶向基因递送方式，严重制约了其应用。既往研究表明，超声靶向微泡爆破（UTMD）是一种靶向、高效的非病毒基因递送技术，而介孔有机硅纳米粒子（MONs）兼具高容量基因负载能力和生物相容性，是良好的非病毒基因载体。本项目拟结合UTMD及MONs构建新型携带转录因子（Gata4、Mef2c、Tbx5: GMT）基因的递送系统，经外周静脉注入心肌梗死模型大鼠体内，在心梗区局部超声作用下，将转录因子GMT基因靶向转运至梗死区成纤维细胞，使其直接重编程为心肌细胞。本研究试图发现提高细胞原位直接重编程效率的新方法，在提高梗死心肌修复效果同时，为其他疾病基因治疗提供一种新策略。

在干细胞治疗领域，通过特定转录因子避开干细胞阶段进而实现体细胞向特定细胞转化的直接重编程技术取得突破，三种心脏发育中的重要因子Gata4、Mef2c及Tbx5组成的GMT因子组合可以直接将成纤维细胞重编程，得到具有部分心肌功能的心肌样细胞。而在材料学领域，超声微泡造影剂（MCA）是成为近年来成熟的基因及药物载体。经外周静脉注射携带基因的微泡后，通过超声辐照某一特定区域，可以实现靶向破坏该区域内微泡（MB），并促进微泡携带物的靶向可控释放。这一称为超声靶向微泡爆破（UTMD）的技术已经逐步运用于心脏治疗领域。目前直接重编程技术以及超声微泡载体结合应用于心脏干细胞治疗仍在探索阶段。本研究拟通过构建了一种靶向控释性能的阳离子微泡/慢病毒基因递送系统。通过超声靶向微泡技术，评价其体外及体内用于修复心肌梗死区域心肌的效率，并评估其进一步转化为临床应用的可能。.本研究人工合成目的基因并构建于中间质粒，通过慢病毒载体系统构建负载Gata4、Mef2c、Tbx5基因的慢病毒载体滴度分别为3.05×108TU/ml、3.25×108TU/ml、3.02×108TU/ml，并通过测序证实GMT直接重编程慢病毒载体的构建成功。合成的阳离子微泡各项表征符合实验标准，最佳病毒/微泡比1000:1，最佳参数为频率1.5 MHz，辐照时间5 分钟， 强度1.5 W/cm2 以及范围1.2 cm。直接重编程后的心脏成纤维细胞通过WB检测证实cTnT、Gata4、Mef2c、Tbx5高表达。体外实验证实慢病毒/阳离子微泡体系体系在最佳参数下可以实现负载，且所构建GMT慢病毒可以实现体外心脏成纤维细胞直接重编程。在最佳参数条件下下，通过经颈静脉注射UTMD组大鼠在心肌梗死后28天组织形态学及影像学检测表明，治疗组大鼠在心梗面积及心功能上都得到了一定程度的改善，并且可以在心梗区域周围看到新生心肌细胞的出现。研究成果表明GMT慢病毒载体可以在体外实现心脏成纤维细胞直接重编程，并且可与阳离子微泡结合形成负载体系。超声靶向微泡爆破技术可以在动物模型体内实现直接重编程慢病毒载体的定向释放并对受损心肌进行修复。