长期超低温保存对海水鱼类精子结构及功能的影响

超低温保存技术已成为种质保存的重要手段。传统观点认为，种质细胞在液氮中可以长久保存，而且其质量可保持稳定。随着相关研究的开展和检测技术的发展，与上述观点相悖的研究报道相继出现，长期液氮保存的持久性、稳定性受到怀疑。长期保存中，精子代谢是否停滞，其结构、生化组成和生理功能是否发生变化及如何变化，已成为该研究领域亟待解决的问题。本课题拟在完善鱼类精子质量检测方法的基础上，以保存1-10年海水鱼类精子为研究对象，系统研究长期冷冻过程中精子的结构、生化组成和生理功能变化及DNA损伤。探明精子在长期超低温保存过程中的结构及功能变化规律，揭示冷冻保存方法和保存过程对精子衰退的作用机理，以期阐明长期超低温保存过程对鱼类精子质量的损伤机理，优化、完善超低温冷冻保存技术。为低温生物学基础理论的发展提供依据，并为超低温保存技术的推广应用和冷冻精子库的建立和管理提供指导。

对超低温保存后的大菱鲆、六线鱼、真鲷、太平洋鳕鱼精子研究发现，冷冻精子平均运动速率和寿命都要低于鲜精的，电镜观察发现40%-60%基本保持正常的形态结构，其他的则不同程度地表现出头部、线粒体、膜的损伤，而且损伤精子中80%-90%带有膜损伤。在太平洋鳕鱼精子保存过程中，发现添加蛋黄能够明显地提高冻存效果。对超低温保存1-10年的真鲷精子研究发现，冷冻精子的运动率随保存时间的延长显著下降，都显著低于鲜精；冷冻精子解冻激活后的运动持续时间和置于4℃冰箱的存活时间也随着保存时间而降低。不同年份的真鲷精子的活性氧含量随着保存时间的延长呈递增趋势，运动率、运动寿命呈下降的趋势。保存9，20，32，43个月的精子膜电位差异不显著，保存79个月的高膜电位精子比例显著低于保存9个月的精子。而且发现, 真鲷鲜精SOD活性显著高于低温保存过的精子，而鲜精MDA含量显著低于冻精。因此我们推测长期保存的冻精可能发生了氧化损伤，抗氧化分子可能通过与活性氧作用，降低活性氧对冻精的质膜完整性、线粒体功能和膜电位的损伤作用。在真鲷精子冷冻保存过程中加入外源还原剂100mM海藻糖和50mM牛磺酸发现，添加还原剂的冻精，其运动率、寿命明显好于普通冻精；可以间接说明加入抗氧化剂后，冻精清除活性氧的效率更高，而且添加还原剂的冻精其质膜较普通冻精相对完整，随着冻存时间的增长，差异会越来越明显。对历年保存的真鲷精子进行单细胞凝胶电泳实验，结果表明各组冻精和鲜精之间彗星率差异不显著，即保存11-83个月的冻精和鲜精之间遗传物质稳定性差异不显著(P>0.05)。人工授精结果显示，虽然保存时间对冻精的生理活性及生化指标影响显著，但是在真鲷和夏鲆中，不同保存时间的冻精受精率、孵化率差异不显著，并且保存10年的冻精受精率、孵化率与鲜精差异不显著。真鲷冻精所获得的子代或者夏鲆冻精与牙鲆的人工授精所获得的子代受精、孵化、苗种培育均正常。