抗体诱导成纤维细胞向肝实质细胞直接重编程的靶点及机制研究

Hepatocytes are the most abundant hepatic cells playing a significant role in the functions of liver. The generation of large numbers of functional hepatocytes for cell-based approaches to liver disease and scientific research is an important and unmet goal. Terminally differentiated somatic cells can be directly reprogrammed into other lineages without reversion to a stem cell state, by overexpressing lineage-specific transcription factors. Direct reprogramming of fibroblasts to hepatic lineages could offer functional hepatocytes to this problem without immunologic rejection and potential tumorigenicity. However all of them achieved by transduction of combination of definite transcriptional factors, in which virus not permitted for clinical treatment were employed. Besides, despite the great potential of these new technologies to obtain hepatocyte-like cells, little progresses have been made to push their applications forward to clinics or industries because of the limited function and expansion in vitro. Moreover, the target and mechanism is still not demonstrated clearly. Antibody is a novel molecular with great promise. We design to establish new methods for direct programming of fibroblast to hepatocyte-like cells by antibodies selected from the intracellular combinatorial antibody library approach. It has been reported that agonist antibody induced receptor pleiotropia for direct programming of cell fate. The agonist antibody not present in nature may give a different dimension to the important problem of signal transduction. Exploring the target and mechanism of the direct cell fate conversion with antibodies is worth looking forward to.

高等动物的成体细胞之间能不通过多能性干细胞阶段而被直接重编程。通过过表达肝脏特异的转录因子组合，能够诱导成纤维细胞重编程成为类肝实质细（iHep）。iHep 细胞具有与肝实质细胞类似的基因表达谱与部分肝细胞功能，重编程得到的肝实质细胞可为肝脏发育和肝脏疾病的研究提供新的模型。然而，成体细胞的重编程都需要转录因子的协同作用，病毒的应用极大的限制了此类方法的发展前景。另外，现有的重编程方法获得的肝实质细胞在体外扩增能力较弱，肝细胞功能不全。而且关于重编程的靶点与作用机制还没有清楚的阐述。因此，我们拟建立抗体诱导的成纤维细胞向肝实质细胞的直接重编程技术。通过细胞内组合抗体库技术，以及高通量的流式细胞分选方法，筛选获得能够诱导成纤维细胞向肝实质细胞直接重编程的激动型抗体，并通过受体抗体的特异性结合，对重编程相关靶点与作用机制进行深入探讨。

肝脏在机体的生理病理过程中起到非常重要的作用，在亚洲肝硬化与肝癌造成的肝衰竭是重要的死亡原因。目前肝细胞移植是临床治疗急性与慢性肝衰竭的重要手段，而细胞直接重编程（转分化）作为一种细胞获取途径不经过干细胞中间态，直接从一种体细胞转化为另一种体细胞，对于细胞治疗和再生医学具有重大的意义。已有多个研究报道实现了成纤维细胞肝向转分化过程，但都面临着效率和安全性问题，此项目计划探索细胞转分化机制，获得功能型抗体能够诱导细胞转分化，为肝疾病治疗和再生医学做出贡献。.首先按照计划，我们在已有研究的基础上成功建立了2因子诱导小鼠成为纤维细胞肝向转分化的模型，为转录因子替代型抗体筛选打下了基础。然后以特异性分泌表达和膜上表达的筛选标记物白蛋白（Alb）和CD26，建立了基于FACS和MACS方法的筛选模型，并用此筛选模型共筛选了约10^9总库容量scFv抗体。在3轮和4轮亚库中看到了标记基因阳性的表型，但在分离单克隆抗体后都未显示出诱导成纤维细胞肝向转分化的能力，有待进一步分析原因。.此后此项目决定改进筛选模型，建立了用CRISPR/Cas9技术在成纤维细胞基因组中alb启动子后敲入报告基因RFP的筛选工具细胞株。这能够降低了抗体结合标记基因时的非特异性、提高了筛选后细胞存活率、减少了由于繁琐筛选步骤带来的序列丢失。此部分筛选工作将于此项目后进行。.除此之外，我们也在年度汇报中加入了新的研究目标：探索细胞转分化的机制研究可以提供直接用于筛选的靶点，因此我们进行了细胞转分化机制的深入研究。在搜寻影响转分化的因素时，我们发现一类PIWI蛋白在转分化过程中时相性表达，并起到负调控转分化作用、稳定表达谱转变的功能。进一步研究发现，Jag1介导的Notch通路参与了MIWI2影响的转分化过程中。这提示我们Notch信号通路作为靶点的转分化诱导或刺激，我们已经获得具有封闭Jag1介导的Notch信号通路的抗体若干，此项目后将进行它们在细胞转分化中作用的验证。