鸟苷酸交换因子net1在斑马鱼胚盾形成和中内胚层诱导中的功能及分子机制研究

Zebrafish embryonic shield organizer, which resides on the dorsal side of the vertebrate gastrula, plays an essential role in patterning the body axis and specifying the mesendodermal layers. The organizer is itself induced by earlier signals. Nodal/Smad2 singnal has essential functions in organizer development and also in the formation of mesoderm and endoderm, but the intrinsic regulation mechanism of Nodal/Smad2 signal during shield organizer formation and mesendoderm induction is unclear. The guanine nucleotide exchange factor net1 is one of the Nodal/Smad2 direct targets as we identified during early gastrula stages. We found that net1 was specifically expressed in the shield organizer, and net1 morphants showed severe defects in organizer formation and mesendoderm induction. In the present study, we will further explore the function of net1 during organizer formation and mesendoderm induction. How the expression of net1 is regulated by Nodal/Smad2 signal pathway and how Nodal/Smad2 signal is controlled by net1 will also be investigated to reconstruct the gene regulatory networks underlying embryonic development. Furthermore, the conserved function of net1 in mesendoderm induction will be studied in mouse embryo stem cell differentiation system.

斑马鱼的胚盾(shield organizer)是原肠期胚胎发育的组织中心，对体轴的建立和中内胚层的形成有着至关重要的作用。斑马鱼胚盾的形成与Nodal/Smad2信号的激活密切相关。然而在胚盾形成过程中对于这些信号通路的调控仍所知甚少。鸟苷酸交换因子net1是我们鉴定的一个Nodal/Smad2的靶基因，在原肠早期特异高表达于胚盾。我们的初步的研究结果表明net1可能通过调控Nodal/Smad2信号通路，在胚盾形成和中内胚层诱导中发挥重要的作用。本项目将深入探讨net1在胚盾形成和中内胚层诱导中的功能，Nodal信号调控net1表达的分子机制和net1对Nodal信号通路的调控机理，构建Nodal信号通过调控其靶基因net1表达，net1又对Nodal信号反馈调控所形成的基因调控网络。本项目还将在小鼠胚胎干细胞向中内胚层前体细胞定向分化过程中，研究net1的功能在进化中的保守性。

脊椎动物的胚胎发育过程中，母源的Wnt/β-catenin信号通路对背部组织中心的诱导和背腹轴的建立非常重要。在斑马鱼胚胎发育至128细胞期，β-catenin已经在背侧胚盘边缘细胞核中积聚，但是一直到中囊胚转换（mid-blastula transition, MBT）时期后才激活下游基因表达。有研究表明，Wnt/β-catenin靶基因启动子区DNA序列及组蛋白的表观遗传修饰在MBT时期的改变是其表达的基础，但β-catenin自身的转录活性在MBT前后是否发生变化，变化的分子机制是什么却知之甚少。.Net1是RhoA特异的鸟核苷酸交换因子（GEF），通过激活RhoA调控着细胞骨架重塑和细胞粘附，因而在肿瘤细胞的迁移和侵润过程中十分重要。我们发现，斑马鱼的net1是合子时期表达的基因，在胚胎胚盾时期特异表达于背部组织中心和边缘区域。敲低net1后，斑马鱼背部组织中心的形成受到严重的抑制，而且背部标记基因的表达也显著下调。胚胎和哺乳动物细胞中的实验表明Net1对于Wnt/β-catenin信号的转导至关重要，而且Net1在斑马鱼早期发育以及Wnt/β-catenin信号通路中的功能是其GEF活性依赖的。在机制上，我们发现Net1调控着β-catenin Ser675的磷酸化，进而增强了β-catenin的转录活性。进一步的实验表明，Net1会打开PAK1同源二聚体，增强了其自身的磷酸化水平，从而引起了β-catenin Ser675的磷酸化及其转录活性的增强。此外，我们进一步发现与其鸟核苷酸交换因子活性无关，定位于细胞核内的Net1通过与Smad2结合，增强Smad2招募组蛋白乙酰化酶p300的能力，促进胚胎中内胚层的形成。.此项研究揭示了在胚胎发育过程中，Net1所调控的β-catenin 675位丝氨酸的磷酸化修饰，是MBT后β-catenin转录活性增强，激活下游基因表达的必要条件。鉴于Wnt/β-catenin信号通路、TGF-β/Nodal信号通路及Net1促进多种肿瘤细胞侵袭和转移，该研究还为深入了解肿瘤发生发展的分子机制提供了新的线索。