紧密连接蛋白及其磷酸化修饰在三阴性乳腺癌血管生成拟态中的作用

In our country, female breast cancer incidence and mortality rates have risen in recent decades. At present, breast cancer has become a serious threat to women's health. Triple negative breast cancer is a a special subtype of breast cancer. Due to the lack of effective therapeutic targets, it is the main blind spot for the clinical. Research shows that vasculogenic mimicry exists in the TNBC tumor and is closely related to malignant features. Our preliminary study found that the abnormal expression of claudin4, claudin6 protein promoted the formation of VM, but the exact mechanism is still not clear. By many experimental methods, this study wants to explore: 1. The formation ability of different types of breast cancer cell; 2. The roles of TJ protein in VM formation by different types of breast cancer cell; 3. Effects of PKC, MAPK, and PI3K/AKT signal transduction pathways on the expression of TJ proteins and their phosphorylation levels; 4. Conformation of TJ protein expression and phosphorylation in tumor VM formation in vitro. This study shall assist our understanding the mechanism of VM formation of TNBC and provide new insights and experimental evidence for drug screening for VM effectively.

我国女性乳腺癌（BC）的发病率和死亡率呈上升趋势，已严重威胁妇女身体健康。三阴性乳腺癌（TNBC）是一种特殊亚型乳腺癌，由于缺少有效治疗靶点，是当前临床治疗的主要盲区。研究表明，TNBC肿瘤中血管生成拟态（VM）的存在与其恶性化特征密切相关。我们的初步研究发现，claudin4、claudin6蛋白异常表达促进VM形成，但其确切机制尚不清楚。本课题拟从紧密连接结构（TJ）作为研究的切入点，应用蛋白质组学、细胞生物学、免疫组织化学和分子生物学等方法进一步研究：1、不同类型乳腺癌细胞VM形成能力变化；2、TJ相关蛋白在不同类型乳腺癌细胞VM形成过程中的作用；3、 PKC、MAPK、PI3K/AKT信号转导通路对TJ蛋白表达及磷酸化水平的影响；4、体外验证TJ蛋白表达及其磷酸化在诱导肿瘤形成VM中的作用。本课题将深入认识TNBC形成VM的机制，为筛选有效的VM治疗药物提供新的思路和实验依据。

本研究在血管生成拟态（VM）形成的复杂分子机制下，以血管紧密连接（TJ）作为研究的切入点和理论基础，结合体内、体外实验来探索TJ蛋白在TNBC细胞形成VM过程中的地位和作用。在项目成员的协作下，该项目进展顺利，基本完成了预期目标。根据研究进展情况，我们还拓展了研究内容，开展了氨基甲酸酯类农药（残杀威）对乳腺癌细胞侵袭能力影响的研究。.在针对不同类型乳腺癌细胞VM形成能力研究方面，我们通过三维细胞培养，发现了高侵袭性的MDA-MB-231细胞可以形成VM结构，而侵袭性低的MCF-7细胞却不能形成VM。此外，两种乳腺癌细胞中Claudin蛋白家族成员表达不完全相同，其中Claudin-4、Claudin-6蛋白表达与VM形成成正比。通过高表达质粒转染和RNA干扰靶蛋白表达，我们率先发现了Claudin-4蛋白与乳腺癌细胞VM形成能力有关，并且发现MAPK ERK信号通路可能参与调节高侵袭性乳腺癌细胞VM的形成。.在乳腺癌干细胞VM形成能力研究方面，我们对MDA-MB-231细胞进行单细胞克隆培养，分离出了Holoclone型、Meroclone型和Paraclone型三种不同形态类型的单克隆细胞。通过三维培养和染色鉴定，发现Holoclone型细胞VM形成能力强，可能具有肿瘤干细胞的特性，并且Claudin-4可能是肿瘤干细胞新的特征性标志物。此外，我们还发现Holoclone型单克隆细胞VM形成能力强，提示其可能具有向血管内皮分化的能力，可能是通过MT1-MMP激活pro-MMP-2，从而参与了肿瘤干细胞VM的形成。抑制Claudin4蛋白的表达可以降低了Holoclone细胞VM的形成能力，进一步证实Claudin-4蛋白可能作为主要的功能蛋白参与了VM的形成。.在乳腺癌移植瘤裸鼠模型的体外实验中，我们成功建立了MCF-7、MDA-MB-231细胞株的原位移植瘤裸鼠模型，证实了裸鼠原位移植瘤中，高侵袭性瘤体中Claudin-4蛋白表达显著高于低侵袭性瘤体，并且ERK1/2活化水平也出现升高。.在残杀威对乳腺细胞迁移能力影响的研究中，我们发现了残杀威能够引起MCF-7细胞发生形态的改变，三维培养可以形成类血管样结构；二维培养下，两种乳腺癌细胞的迁移能力均增强，可能是通过激活ERK/MAPK 信号通路，介导以Nrf2 为核心的抗氧化防御体系，继而增加了