无尾两栖类寄生纤毛虫—肠肾虫的分类与系统发育研究

The nyctotherans are widespread clevelandellid ciliates that have been found from digestive tracts of both vertebrate and invertebrate animals, especially from the recta of anuran amphibians. It is significant for basic biology of Clevelandellida ciliates and therapeutics of corresponding diseases to study the taxonomy and phylogeny of nyctotherans inhabitating anuran amphibians. In order to elucidate their origin and phylogeny, we will conduct a detailed investigation on Chinese local nyctotherans infecting anuran amphibians in different habitat types and study them from five aspects including morphology, DNA Barcoding, molecular phylogeny, cultivation and pathological analysis. At the same time, modern taxonomic techniques and COⅠgene and 18S rDNA as molecular markers will be used together to explore the validity of morphological species, to redescribe the typical families and genera, to reveal their phylogenetic relationships, and thus to infers their systematic evolution and origin. Moreover, the coevolution pattern of nyctotherans and their hosts will be analysed and their host specificity will also be evaluated. If completed according to the experimental plan, the controversy about origin and phylogeny of nyctotherans will be solved and a convincing taxonomical system of Clevelandellida ciliates will be provided. In addition, it will be beneficial to provide an excellent research model of parasite-host relationship and be helpful to the reasonable evaluation, prevention and medical treatment of nyctotheran diseases.

肠肾虫是一类寄生于多种无脊椎和脊椎动物肠道的克氏目纤毛虫，其中尤以无尾两栖类宿主来源的物种最为丰富。研究无尾两栖类寄生肠肾虫的分类与系统发育关系，对探讨克氏目纤毛虫的进化和无尾目经济动物相应病害的评估、防治等方面均有重要意义。本项目拟在对我国无尾两栖类寄生肠肾虫的本底资源进行全面调查的基础上，从形态分类、DNA条形码、分子系统发育、体外培养与保种、病理学等五个方面开展研究。通过现代标准的形态分类学和分子生物学研究的联合探讨，厘定本类群现存的分类学混乱和错误，重新刻画肠肾虫不同科、属典型特征，探讨其系统发育模式、梳理其进化关系。本项目的完成将极大丰富肠肾虫的物种资源，构建本类群完善的形态学资料库、DNA条形码数据库和保种细胞库，填补其系统发育研究的空白，为研究寄生虫-宿主的协同进化关系提供良好模型，并为具有重要药用、营养价值的无尾目经济动物肠肾虫病害的合理评估和防治策略的制定提供理论基础。

肠肾虫是一大类广泛寄生于多种无脊椎动物和脊椎动物消化系统内的纤毛虫，其宿主涉及淡、海水及陆生生境的多个动物类群（环节动物、软体动物、节肢动物、鱼类、两栖类、爬行类），其中尤以无尾两栖类宿主来源的物种最为丰富。但长期以来，由于本类群的很多物种形态较为相似以及常存在混合感染等情况，再加上研究者在开展本类群的分类学研究时所基于的视角和观点存在较大差异，造成了当前肠肾虫的分类研究中存在诸多混乱和错误。本课题在广泛收集无尾两栖类寄生肠肾虫样品的基础上，通过形态学和分子生物学的联合探讨，研究了其分类和系统发育关系，探讨了克氏目的系统发育模式；评估了核基因和线粒体基因作为本类群条形码候选基因的可行性；选取了巨咽拟肠肾虫成功进行了离体培养，建立了其单克隆纯系。（1）形成了一整套适用于肠道寄生纤毛虫研究的技术手段，包括虫体的分离、形态分类（活体观测、蛋白银、干银法、苏木精染色）、超微构造（扫描、透射样品制备）、系统发育、病理学、体外培养、单细胞组学测序等；（2）刻画了3科、5属、19种肠肾虫的形态学特征；考量了肠肾虫的分类依据，认为寄主及寄生部位、虫体形状及左右分面情况、口沟长度及占体长比例、胞咽管尺寸及弯曲程度、大小核的形状、尺寸和相对位置关系、伸缩泡数目及位置是稳定和重要的分类特征；（3）支持克氏目为单系发生，其中克氏科和管口科为单系性，肠肾科为并系性；拟肠肾虫属、克氏属为单系发生，肠肾虫属为并系发生，且克氏属起源于肠肾虫属；拟肠肾虫属聚为无尾类宿主分枝，肠肾虫属、克氏属聚为节肢动物宿主分枝；（4）分别对肠肾虫样品的核SSU、ITS1、ITS2 和 LSU rRNA 高变异区和线粒体 COⅠ基因五种分子标记进行了遗传多样性研究，结果显示ITS2 既有一定的变异性，同时种间又有十分稳定的区域，是良好的可区分肠肾虫近缘物种的DNA条形码基因；（5）选取巨咽拟肠肾虫作为典型物种，开展了其实验室内离体培养的探索，确定了适合其生长的最佳培养基组分，成功建立了其单克隆纯系；为后续实验寄生虫学研究工作的开展打下了良好的基础。