杯体虫的分类与系统发育研究

杯体虫是一类分布广泛、可严重危害多种水产经济动物的固着类纤毛虫。本项目拟在广泛收集（国内）和索取（国外）杯体虫样品的前提下，以形态学为基础，将基于COⅠ基因的DNA Barcoding 技术引入到杯体虫的分类研究中；并结合以核糖体18S rDNA分子标记为主的分子生物学手段，对杯体虫进行较全面的系统发育研究。通过形态学和分子生物学研究的联合探讨，厘定在杯体虫种类鉴别中存在分歧的已知种，理清杯体虫分类的混乱局面；构建较为完善的缘毛亚纲和杯体虫属的系统发育树，界定杯体虫属在缘毛亚纲科级分类阶元上的归属问题，阐明其起源和系统发育模式。本项目的完成将会阐明杯体虫的分类与系统发育关系，并为完善整个缘毛亚纲的分类系统奠定有力的理论依据，同时为重要水产经济动物杯体虫病害的合理评估和相应防治策略的制定提供理论基础。

杯体虫是一类分布广泛、可严重危害多种水产经济动物的固着类纤毛虫。大量附生时能严重危害各种养殖的鱼苗、鱼种及虾、蟹的卵、幼体和成体，并能导致宿主大量死亡。长期以来，由于杯体虫形态的多变性和可寄生宿主的广泛性，使得对该类群物种的分类鉴定十分困难。本课题在广泛收集杯体虫样品的基础上，通过形态学和分子生物学的联合探讨，研究了其分类和系统发育关系，探讨了杯体虫在缘毛亚纲科级分类阶元上的归属问题。（1）形成了一整套用于形态高度变异的寄生缘毛类纤毛虫研究的技术手段，包括虫体的分离、显微结构研究（活体观测、活体染色、蛋白银、干银法、银浸法、苏木精染色）和超微构造研究（扫描、透射样品制备）；确定了十二个特征参数作为其形态学研究的可靠指标，其中大小核的形状、尺寸和相对位置关系是最为稳定和重要的分类特征；（2）利用病理组织切片及电镜技术系统研究了杯体虫超微结构特征及虫体对宿主的病理影响：发现杯体虫以帚胚末端微纤维附着层中的纤维物质汇入宿主细胞表面的纤维节，并与其膜下纤维发生交连，引起了膜下纤维带的出现，但并没有穿破宿主的上皮细胞膜；发现虫体口区存在很多的细菌体和有机颗粒，其食物来源于外界水环境而并非宿主；因而从帚胚与宿主上皮细胞接触处的超微结构及杯体虫食物源两方面确认其是外共生体而非寄生体；（3）分别对杯体虫样品的线粒体COⅠ基因和细胞核的3种基因ITS1、ITS2和LSU rRNA高变异区四种分子标记进行了遗传多样性研究，结果显示COⅠ基因在不同种间的变异程度高于核基因的分子标记；ITS2既有一定的变异性，同时种间又有十分稳定的区域，非常有利于设计种间特异性引物；（4）在引入杯体虫18S rDNA序列基础上，构建了缘毛类的分子系统发育树，较好区分了缘毛类的主要科级阶元；结果显示杯体虫在缘毛亚纲科级分类阶元上的归属倾向于累枝虫科，这是首次对杯体虫种类从分子系统学角度进行探讨。本课题的完成突破了仅依靠传统的形态学性状无法解决的杯体虫分类工作，填补了本类群分子生物学研究的空白；明确了其科级归属，为完善缘毛亚纲的分类系统提供了重要的信息和依据；同时为重要水产经济动物杯体虫病害的合理评估提供了理论基础。