力对DNA解旋酶活性的影响、相关的分子机制及可能的调控机理研究

Force is an important regulation parameter often adopted by cells in many life processes such as cell motion, signal transduction and genome maintenance, to name just a few. The effects of force have long been the subjects of Mechanobiology. But direct evidences of them are still very rare in the DNA metabolism at the molecular level. In our recent research on a DNA helicase called Pif1, we found that the enzymatic activity of Pif1 is strongly enhanced by the force in our magnetic tweezers assays. We therefore assumed that cell uses this enhancement effect to regulate the activity of Pif1 in a very important DNA repair pathway called the DNA break-induced replication (BIR) because the D-loop structure in the BIR creates a strong tension on DNA. In this project we will study the effect of force on the activity of DNA helicases, the relevant molecular mechanism and the potential regulation functions. We will use single molecule techniques to study how the force affects the activity of the Pif1 and try to understand the relevant molecular mechanism. We will also mimic the BIR process in vitro to demonstrate our assumption and clarify the role of Pif1 in this processs.

力在细胞的很多重要生理过程（例如细胞运动、信号转导、免疫反应甚至基因的维护等等）发挥重要调控作用。力的重要性在力学生物学中得到了充分的重视。但在细胞内，特别是在分子水平，力起重要作用的直接证据还不多。我们在前期的初步研究中发现，力能促进一个叫Pif1的解旋酶的持续解旋能力。这使得我们联想到最近的一个重要的但无法解释的发现：本来解旋能力不高的Pif1却在断裂诱导的DNA复制过程（BIR）中要解开很长的DNA。我们认为BIR过程所产生的D-loop (D-环)结构中的力是调制这一生理过程的重要因素。本项目中我们利用高精度单分子技术（磁镊和FRET），以碱基分辨能力研究Pif1解旋酶的细致解旋动力学过程，探讨Pif1解旋的分子机理以及力增强Pif1解旋活性的机制。我们还将在体外单分子水平模拟BIR过程，验证我们提出的重要假设，阐述Pif1在BIR中起重要作用的分子基础。

力在细胞的很多重要生理过程（例如细胞运动、信号转导、免疫反应甚至基因的维护等等）发挥重要调控作用。经过四年的努力，我们测量了多种DNA解旋酶的解旋过程，得到了在力的调控下各自不同的解旋机理。在这些实验中，我们尽量模拟了断裂诱导的DNA复制过程（BIR），在解旋、跨损伤等多方面重现了BIR的部分中间过程。此外，我们还拓宽了研究范围，对BIR过程中的相关蛋白也进行了研究；开发了表面诱导荧光衰减技术（SIFA），一举突破膜蛋白位置测量的技术瓶颈，可实时测量膜蛋白插膜的动力学；改进了FRET和磁镊方法，使得测量精度大大提高；用单分子力谱揭示了染色质纤维的中间态结构等。这一系列的成果不仅从单分子层面揭示了力的重要作用，还在一定程度还原了BIR过程，并且在多方面进行了技术创新和改进，为将来的深入研究奠定了基础。