miR858调控丹参迷迭香酸合成的机理研究

迷迭香酸由苯丙烷和酪氨酸代谢途径产生,是丹酚酸B等酚酸类活性化合物的核心前体。我们发现，过表达拟南芥PAP1转录因子可显著提高丹参中丹酚酸B的含量，而丹参中miR858对PAP1的表达具有潜在负调控作用。我们推测，丹参中可能存在【miR858表达→PAP1表达水平→关键酶基因表达→迷迭香酸合成】这样一种调控模式，而且PAP1对miR858的表达可能也有调节作用。本课题拟通过分析miR858过表达和沉默丹参株系中PAP1表达的变化，明确miR858对PAP1的负调控；比较丹参中上调或沉默PAP1后miR858的表达变化，探究PAP1对miR858表达的调节作用；进而在丹参中同时过表达PAP1和沉默miR858，通过研究转化株系内miR858调控PAP1的表达对迷迭香酸及其酚酸类成分合成的影响，揭示丹参中miR858调控迷迭香酸合成的分子机制，为通过对miRNA的调控进行分子育种奠定理论基础。

丹参是我国传统大宗道地药材。迷迭香酸及其它酚酸类化合物是丹参中的主要活性成分，由苯丙烷类和酪氨酸代谢途径产生。目前对丹参迷迭香酸生物合成途径调控机制的研究主要侧重于探讨相关转录因子对关键酶基因表达的调控，而相关转录因子自身表达调控的研究报道较为少见。MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为22 个核苷酸的内源单链非编码RNA，通过负调控相关转录因子基因的表达来控制植物个体生长发育，是一种新的基因调控方式。因此，在miRNA水平研究参与丹参迷迭香酸生物合成途径调控的转录因子基因的表达调控，阐述转录因子被相应miRNA介导的负调控作用机制，能够为进一步通过基因工程提高丹参体内转录因子的表达水平奠定一定的理论基础。前期研究结果显示，SmPAP1作为一个转录因子正向调控迷迭香酸生物合成，但关于丹参体内SmPAP1的表达调控机制尚不清楚。因此，本课题为了探究SmPAP1在miRNA水平的调控，首先利用“modified 5’RACE”体外分析了丹参miR858对PAP1 mRNA的作用位点；然后利用artificial-microRNA载体构建原理和方法分别构建过表达miR858以及对MIR858进行特异性沉默的植物表达载体，利用上述所构建载体分别对丹参进行转化，获得了相应的转基因丹参植株，体内明确miR858对SmPAP1的靶向负调控作用。为了进一步探究丹参体内是否存在SmPAP1对miR858表达丰度的反馈式调节作用，构建了“miR858作用位点”定点突变的35S-pro:PAP1mutBS(PAP1R)和特异性沉默SmPAP1的植物表达载体并分别对丹参进行转化获得相应的转基因丹参植株，旨在分析在SmPAP1表达水平显著升高、下调的状况下丹参转化植株内miR858表达丰度的变化。实验结果显示，丹参体内miR858对SmPAP1的确具有靶向负调控；丹参体内SmPAP1对MIR858表达似乎并不具有明显的的反馈式调节作用；与对照植株相比，MIR858特异性沉默的转基因丹参植株中迷迭香酸和丹酚酸B的含量分别提高了2.9和2.1倍。因此，该项目研究结果暗示，通过基因工程特异性沉默MIR858的表达，解除丹参miR858对SmPAP1表达的抑制作用，可以提高丹参体内SmPAP1的表达水平，实现在miRNA水平调控丹参迷迭香酸的生物合成。