丹参迷迭香酸合成酶与细胞色素P450蛋白(CYP98A14)的功能及表达特征研究

利用细胞工程及基因工程手段调控植物中化学成分合成途径，提高活性物质的含量是近年研究的热点，而弄清植物中代谢途径调控特征是实现这一目标的基础。本课题以丹参迷迭香酸合成途径为目标途径。选取催化丹参中迷迭香酸合成途径中对整个途径起关键调控作用的最后两个步骤关键酶- - - - 丹参迷迭香酸合成酶及细胞色素P450羟化酶（CYP98A6）。拟首次分离丹参迷迭香酸合成酶和细胞色素P450羟化酶（CYP98A14）及编码基因，并通过纯化蛋白及转基因丹参毛状根进行功能研究。在此研究基础上，整体考察丹参中迷迭香酸合成途径的特征，为利用代谢工程手段提高丹参中酚酸类成分提供可靠依据。

丹参中，迷迭香酸（RA）和丹参酚酸B（LAB）是最主要的苯丙素类活性化合物。植物中的苯丙素类化合物包括众多结构类型的活性物质，在苯丙素合成途径中，迷迭香酸合成酶（Rosmarinic acid synthase, RAS）与CYP98A14是特异催化RA生成的关键酶。因此，这两个酶的功能研究对更准确了解丹参中酚酸类活性物质的合成特征具有重要意义。本研究对丹参RAS及CYP98A14的编码基因进行了表达特征研究；通过RNAi的方法，对其进行了功能研究。结果表明，丹参中RAS与CYP98A14的表达显著影响RA与LAB在丹参中的合成与累积。利用13C标记苯丙氨酸饲喂的方法，对RA生物合成途径中间产物进行监测，结果说明，丹参中RA的生物合成过程具有种属特异性。本研究对丹参中RA的生物合成过程进行了多层次的研究，通过同位素标记，更精确地描述了RA在丹参中的生物合成过程；通过RAS及CYP98A14的亚细胞定位的研究，首次对植物中RA的胞内合成特征进行了探索。同时，RAS与CYP98A14的功能研究证明这两个酶是开展丹参中酚酸类活性物质代谢调控的有效靶点。