三色堇花斑色素形成关键基因的发掘

植物的花斑是重要的观赏性状。研究和发掘花斑色素形成的关键基因，对于深入了解植物花色素苷基因在花瓣特异区域的表达机制有重要的理论意义，并可以为采用基因手段创造具有较高观赏价值的素心品种提供理论基础。本项目以三色堇为研究对象，采用HPLC的方法确定花斑色素的主要成分，以三色堇、角堇和其他植物已克隆的色素基因为基础，克隆三色堇花斑区域的花色素苷基因或其部分序列；利用Real-time PCR对比分析花斑区与非花斑区的基因表达，发现并克隆具有明显表达差异的关键基因；利用热不对称交错PCR技术克隆该基因的启动子序列；然后对基因及其启动子序列进行分析，并对启动子进行瞬时表达分析，了解其与色斑形成的可能关系。本项目的实施，不仅可以克隆和分析三色堇花斑色素的产生的关键基因，更重要的是可以了解花斑的产生与花色素苷基因及其启动子特异性表达的互作模式，为观赏植物花斑的深入研究提供重要的参考价值。

本项目的主要目的是通过研究三色堇花斑色素的组成，克隆与花色素合成相关的基因，并对这些基因在花瓣色斑区和非色斑区的表达进行对比研究，进而确定其表达差异与色斑形成的关系，判断哪些基因是决定花色色斑形成的主要基因。项目已经完成主要研究内容并取得以下研究成果：1.建立了三色堇花色素分离、纯化和HPLC-MS检测的技术流程，并利用HPLC-MS技术鉴定出三色堇花瓣色斑区的主要色素是矢车菊素与飞燕草素，其中矢车菊素是主要成分（82.94%），飞燕草素占17.06%。2.成功建立了三色堇的RNA提取技术体系、cDNA转录体系、PCR反应体系、RACE技术体系，并在国内外首次成功克隆了三色堇花色素合成的六个关键基因：chalcone synthase (VwCHS), chalcone isomerase (VwCHI), flavanone 3-hydroxylase (VwF3H), flavonoid 3'-hydroxylase (VwF3'H), dihydroflavonol 4-reductase (VwDFR) and anthocyanidin synthase (VwANS)，并在Genbank上进行了登录(GenBANK accession numbers: KJ463619 - KJ463624) 。3.对这六个基因的序列、相应的蛋白质结构等进行了基因信息学的分析与验证，确认这六个基因是属于各自相应的基因家族。4.建立了三色堇实时定量PCR反应体系，并利用该体系对三色堇在色斑区与非色斑区的七个开花阶段的七个花色素合成基因（VwCHS, VwCHI, VwF3H, VwF3’H, VwDFR, VwF3’5H 和 VwAN) ）的表达进行了对比研究，发现了七个基因在不同花发育阶段的表达水平不同，主要表达时期集中于花蕾期和开花初期，开花后期花色素基因表达水平迅速下降；在这七个基因中，主要是DFR和ANS两个基因在花斑区与非花斑区的表达有极显著差异，并且与花色素的含量变化相关，说明这两个基因可能是决定花斑形成的主要基因。项目达到预期目的，确定了三色堇花斑形成的关键基因。5. 建立了三色堇基因组DNA提取体系与与热不对称PCR反应体系，进行了启动子的克隆，已克隆到约500bp的VwDFR基因的上游序列。