KLF6-SV1通过上调Twist1和募集肿瘤相关巨噬细胞影响非小细胞肺癌转移的机制研究

Metastasis is the main cause of treatment failure and death in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), so it is important to clarify the mechanism of how metastasis occur in NSCLC. In previous study we discovered that tumor-associated macrophages (TAMs) acted to facilitate metastasis by binding tumor cells and mediating their intravasation. Moreover, researchers found Krüppel like factor 6 splice variant 1 (KLF6-SV1) can induce up-regulation of the transcription factor Twist1 and Twist1 can modulate macrophage recruitment. Therefore we assume KLF6-SV1 can promote NSCLC metastasis via the recruitment of macrophages and increase tumor malignancy. By using several Laboratory Techniques such as zebrafish tumor model, confocal microscopy imaging, immune magnetic activated cell sorting, whole mount staining，we attempt to further reveal the detailed mechanism of how KLF6-SV1-Twist1-TAMs promote NSCLC metastasis and provide potential new targets for the treatment of NSCLC.

转移是非小细胞肺癌NSCLC病人治疗失败和死亡的主要原因，因此明确NSCLC发生远处转移的机制是改进治疗效果的重要一环。我们的前期研究发现肿瘤相关巨噬细胞TAMs可以通过携带肿瘤细胞进入血液循环来向远隔器官转移。而有研究发现Krüppel样锌指转录因子剪接体KLF6-SV1可以上调转录因子Twist1的表达，Twist1又可以调节巨噬细胞的聚集，因此我们推论KLF6-SV1可以通过募集巨噬细胞来促进NSCLC的浸润和转移，使肿瘤恶性程度大大增加。本课题中我们将利用斑马鱼肿瘤模型、共聚焦显微成像、免疫磁珠细胞分选MACS、Whole mount staining等技术，进一步明确KLF6-SV1-Twist1-TAMs轴影响NSCLC转移过程中的详细机制，为NSCLC的治疗提供潜在新的靶点。

本课题主要研究了KLF6-SV1通过肿瘤相关巨噬细胞促进肺癌转移的机制。首先建立了KLF6-SV1高表达和低表达的肺腺癌A549细胞系，在KLF6-SV1高表达组Twist1和CCL2的mRNA和蛋白表达水平明显提高，而在siKLF6-SV1组Twist1和CCL2的mRNA和蛋白表达水平明显降低。进一步研究显示KLF6-SV1可以提高M-CSF的表达水平。免疫组化染色结果显示KLF6-SV1高表达组中，CD163阳性的TAMs比例明显升高，说明KLF6-SV1可以诱导巨噬细胞极化为M2亚型的巨噬细胞。通过比较实验组、对照组和空载体组之间肿瘤大小及重量，发现抑制KLF6-SV1的表达可以明显抑制肿瘤的生长。在KLF6-SV1高表达组，E-cadherin的mRNA和蛋白水平要显著低于对照组，N-cadherin和MMP-9的表达水平要明显高于对照组，而KLF6-SV1低表达组的实验结果与高表达组恰好相反。共转染实验发现沉默Twist1基因可以抑制KLF6-SV1促进肿瘤细胞生长的作用，沉默Twist1基因可以下调CCL2的表达以及KLF6-SV1引起的M-CSF的表达。Transwell实验表明过表达KLF6-SV1可以促进A549细胞的迁移能力，而沉默Twist1基因又可以抑制这种现象。通过M-CSF诱导THP-1细胞系我们得到了高表达CD163和低表达CD68的M2巨噬细胞。Transwell实验表明M2巨噬细胞和A549细胞共培养组、M2巨噬细胞和高表达KLF6-SV1的A549细胞共培养组、M2巨噬细胞和低表达KLF6-SV1的A549细胞共培养组中A549细胞的迁移能力均强于相应的对照组。qRT-PCR和Western blot实验表明M2巨噬细胞和A549细胞共培养组、M2巨噬细胞和高表达KLF6-SV1的A549细胞共培养组、M2巨噬细胞和低表达KLF6-SV1的A549细胞共培养组中EMT相关基因N-cadherin和MMP-9的表达水平明显高于相应的对照组，而E-cadherin的表达则明显降低。通过体内及体外实验结果，我们证明在肺腺癌中高表达KLF6-SV1可以促进Twist1的表达，进而通过促进CCL2的表达诱导M2巨噬细胞的浸润，从而通过加速EMT的进程来促进肿瘤的转移，因此靶向KLF6-SV1可能成为肺癌治疗中一个新的有希望的治疗手段。