影响三色堇花斑形成的MYB类转录因子的分离与功能分析

This project is to clone and analyze the MYB transcription factors in the petal of pansy (viola wittrockiana), an ornamental plant with typical flower blotch. The gene expression difference of MYB transcription factors between the blotched part and non-blotched part of petal will be detected, and then the candidate MYB genes effecting the formation of blotch will be chose. The chosen MYB genes will be transformed into the non-blotched part of petal with particle bombardment and transient expression technique, and the response of the pigment formation and the expression of anthocyanin synthase genes to the MYB genes will be analyzed. On this basis, the possible bHLH and WD40 genes in petal wil also be cloned, and the interactions between MYB gene between bHLH or WD40 gene will be studied with Yeast Two-hybrid Technique. As a result, we try to clarify the numbers, types, the target genes and the regulation pattern of MYB genes related to the formation of petal blotch of pansy. This project will be helpful for the better understanding of the plant anthocyanin regulation mechanism and the formation of petal blotch, and also can provide a new possible strategy for the breeding of plant with blotched or non-blotched flowers.

本项目是以观赏植物中具备典型花斑的三色堇为研究材料，通过同源序列克隆其花瓣中的MYB转录因子，分析花瓣中花斑区与非花斑区MYB转录因子的表达差异，进而筛选出可能影响花斑形成的MYB基因。然后在克隆花瓣花色素苷合成酶基因的基础上，通过粒子轰击瞬时表达，将MYB基因导入非花斑区，研究色素形成和花瓣花色素苷合成酶基因对MYB基因的响应，从而推测MYB影响的花色素苷合成酶基因。在此基础上，克隆花瓣中可能存在的bHLH和WD40型基因，并利用酵母双杂交技术，研究MYB基因与bHLH和WD40型基因可能存在的互作关系。最终综合上述研究结果，弄清调节与三色堇花斑形成相关的MYB因子的数量、种类、作用的目标基因以及调控的模式，从而对MYB转录因子调控花斑形成机理进行系统研究。研究的结果可以丰富植物花色素苷基因表达调控及花斑形成理论，也可以为通过基因手段创造具有色斑或不具色斑的花卉类型提供理论基础。

本项目是以观赏植物中具备典型花斑的三色堇为研究材料，通过转录组数据及同源序列克隆其花瓣中的MYB转录因子，分析花瓣中花斑区与非花斑区MYB转录因子的表达差异，进而筛选出可能影响花斑形成的MYB基因。然后在克隆花瓣花色素苷合成酶基因的基础上，通过粒子轰击瞬时表达，将MYB基因导入非花斑区，研究色素形成和花瓣花色素苷合成酶基因对MYB基因的响应，从而推测MYB影响的花色素苷合成酶基因。在此基础上，克隆花瓣中可能存在的bHLH和WD40型基因，研究MYB基因与bHLH和WD40型基因可能存在的互作关系。研究主要结果如下：通过转录组测序得到29条MYB基因序列，14条bHLH基因序列，77条WD40序列。将各类转录因子unigene序列分别与拟南芥中相应基因序列进行多序列比对，通过同源性分析对基因功能进行初步预测,同时进行荧光实时定量分析，克隆了与三色堇花斑区、非色斑区存在表达差异的MYB基因3个（Vw MYB8、Vw MYB27、Vw MYB29）、bHLH基因1个（VwbHLH1），并进行了粒子轰击瞬时表达验证分析，发现在Vw MYB8、Vw MYB27三色堇花瓣非色斑区域中瞬时表达均无颜色变化，转化月季花瓣出现红色斑点。Vw MYB29轰击三色堇花瓣非色斑区域出现颜色加深现象，轰击月季花瓣出现了明显红色斑点。表明3个MYB基因均可促进花色素合成，其中Vw MYB29可能与三色堇色斑形成有直接关系。研究结果未发现MYB基因与bHLH基因、WD40基因的协作作用。