重组人ZP多表位肽检测抗原的构建以及女性不孕和卵巢早衰ZP自身免疫病因学的研究

The autoimmune of human zona pellucida (huZP) proteins has been considered to be one of the causes of infertility or premature ovarian failure (POF) in women. However, there has been no direct clinical evidence so far due to unavailability of native huZP proteins to test ZP antibodies in sera from infertility women. In this study, a recombinant multi-epitope peptide antigen (MEPA) instead of native ZP proteins will be condtructed, which will be composed of ten or more linear B cell epitopes from human ZP2, ZP3 and ZP4 proteins. In addition, 1000 sera from women with infertility or POF will be collected in Shanghai, and testing the ZP antibodies in those sera will be carried out using codtructed MEPA in western blotting. That is, the goal of the research is to provide a exclusive chain of evidence that there are indeed ZP-antibodies in sera from women with infertility and POF, including the incidence of ZP-autoimmune diseases in Shanghai area. The significance of this study lies in: 1) it will be the first time to reveal all and precise linear B cell epitopes of human ZP2 protein ; 2) the strategy of constructing MEPA will represent the future direction in the clinical diagnosis field, because the MEPA will has advanteges of high specificity and high sensitivity; and 3) the new concept of epitope marker for disease diagnosis will be established through using positive sera of ZP antiboies to screen serum-neutralizing epitopes, which it will consist of several epitope markers to one or more target antigen and more specific compared with a protein marker.

人卵透明带（ZP）蛋白自身免疫一直被认为是导致妇女不孕和卵巢早衰的病因之一，但由于缺乏理想的检测抗原，故迄今未得到临床检测数据来予以证实。本项目拟在前期已鉴定ZP3和ZP4线性表位的基础上，继续鉴定ZP2线性表位，然后通过设计含有人ZP2、ZP3和ZP4蛋白分子中多个线性表位的重组多表位肽，制备能代替天然ZP蛋白的检测抗原，并通过病例-对照研究，对1000例上海地区女性不孕/卵巢早衰患者血清中存在的自身ZP抗体情况进行检测，以证实ZP自身免疫性病因，并初步了解其阳性率。通过本项目的实施，能最先明确人ZP2蛋白分子中的线性表位，建立基于多个不同蛋白分子中线性表位最小基序的多元重组表位肽检测抗原的制备技术，筛查出女性不孕和卵巢早衰患者血清所能识别的人ZP蛋白B细胞线性表位，从而验证由一个或数个靶蛋白的若干线性B细胞表位组成的"表位标志物"用于特定疾病临床诊断的可行性，开辟临床检验学发展新领域。

人卵透明带（zona pellucida，ZP）由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4蛋白组成, 是研制免疫避孕制剂以及女性不孕和卵巢早衰（POF）检测诊断试剂的理想靶抗原，而ZP蛋白抗原表位的鉴定是设计研发上述制剂不可或缺的基础性工作。本项目围绕原定目标和计划研究内容，完成了1）人精子受体ZP2蛋白的分段原核表达；2）用纯化重组人ZP2N39-320和ZP2C312-640蛋白作为免疫原免疫家兔的多克隆抗体制备及其效价测定；3）应用本团队建立的生物合成肽法（BSPM）和兔抗ZP2多抗对人ZP2蛋白分子中完整IgG-表位组的扫描作图；4）含有人ZP2、ZP3和ZP4蛋白14个表位的新型重组多表位肽抗原的构建和表达；和5）570例女性不孕或POF妇女患者血清样本的收集及ZP抗体的筛查等研究；并获得了以下三方面的重要成果，一是完善了我们的原创性BSPM技术，这一新命名的GST188-BSPM技术使IgG-表位鉴定工作更为方便经济，且成功应用于HPV蛋白中IgG-表位的鉴定；二是绘制了人ZP2蛋白上由20个表位构成的完整IgG-表位组，丰富了ZP抗体表位标志物库，也为今后研制多表位肽避孕疫苗提供了有更多选择的候选表位；三是成功制备了国际上第一个组合了三种人ZP 蛋白中14个表位的新型重组ZP多表位肽抗原，可用于临床筛查女性不孕或POF妇女患者血清中是否存在自身ZP抗体。本项目研究结果的重要科学意义主要体现在：再一次证实GST188-BSPM技术可广泛应用于任一靶蛋白分子中全部IgG-表位的精细鉴定，为表位组学研究提供了必要的技术；提供了ZP自身免疫是导致妇女不孕和POF疾病因素之一的直接证据；表明了开展线性表位组学研究的重要性，它不仅可以提供人类自身免疫疾病筛查的表位标志物、而且能提供构建替代稀有抗原并提高检测特异性和灵敏度的重组多表位肽，以及设计研制多价疫苗免疫原的候选表位。