基于TLR4/NF-κB信号通路探寻石上柏双黄酮类抗心肌缺血再灌注损伤成分及其作用机制研究

Ischemic heart disease is a serious cardiovascular disease,which is the main cause of death and heart failure.Due to the complex pathogenesis, there is still no very effective prevention and treatment of these diseases.Although surgical treatment is often used in clinical practice, because of the serious postoperative recurrence, drug therapy is still the main prevention and treatment of these diseases.Selaginella doederleinii Hieron has been used in the treatment of palpitation, which has been proved that it has anti-myocardial ischemia effect, but the substance and mechanism of action have not been clear.The discovery of total bisflavonoids from Selaginella doederleinii according to previous studies by the applicant extract（SDTF）significant dependence on myocardial ischemia and hypoxia and protection of myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI）The effect is related to the TLR4/NF- kappa B signaling pathway.In order to further clarify the target components of MIRI in TBF, it was proposed to rapidly isolate the bisflavonoids by using AB-gel-semi -preparing-HPLC technique. Then the active components were quickly screened by "compound library preparation, activity evaluation and structural identification integration" and virtual screening based on ligands / receptors.At the same time, the MIRI model was used to identify the anti reperfusion injury of target biflavones and to explore the mechanism of TLR4/NF- kappa B signaling pathway.In order to provide support for the discovery of more active anti-myocardial ischemia drugs, the basis of anti-myocardial ischemia substances and the structure-activity relationship of bisflavone compounds in Phellodendron chinensis were elucidated.

缺血性心脏病是导致心功能衰竭和死亡的主要原因。石上柏在民间被用来治疗心悸，也有研究标明其具有抗心肌缺血作用。根据前期研究发现石上柏总双黄酮（SDTF）具有显著的抗心肌细胞缺血缺氧和保护心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的作用，其作用与TLR4/NF-κB信号通路有关。目前，尚未明确具体发挥作用的双黄酮成分，为进一步明确SDTF中抗MIRI的有效成分，首先拟采用自制凝胶联用高效液相技术精确分离得到更多结构新颖的双黄酮类成分，同时根据“化合物库-活性评价-结构鉴定一体化”技术和基于配体/ 受体的虚拟筛选技术快速筛选得到有效的双黄酮成分；再将确定活性的双黄酮化合物经心肌细胞和MIRI模型实验，明确具有改善再灌损伤的作用，并探讨其作用机制；阐明石上柏中双黄酮化合物抗心肌缺血再灌注损伤的物质基础，为寻找发现活性更强的抗心肌缺血药物提供支持。

本课题组基于配体垂钓技术和网络药理学筛选发现穗花杉双黄酮可能对心肌缺血再灌注损伤具有治疗作用，并能够有效抑制乳酸脱氢酶。通过微波结合离子液体提取中药石上柏中总双黄酮，采用响应面设计优化了提取工艺，提取效果优于传统提取方法；又将低共熔溶剂作为溶剂应用于江南卷柏双黄酮的提取。首次制备得到新型共价有机聚合物材料（AB-COP），并对该材料作了结构表征；优化了AB-COP-semi-preparing-HPLC技术在线纯化和分离石上柏双黄酮的方法， 共分离得到13个双黄酮，而且AB-COP的吸附和解析效果均优于传统分离材料。采用UPLC-ESI-MS/MS对大鼠血浆中的3种双黄酮（穗花杉双黄酮、银杏双黄酮及扁柏双黄酮）建立了灵敏可靠的定量检测方法；此外，转录组学测序结果显示石上柏总双黄酮处理的H9C2心肌细胞中有2123个差异表达基因，差异表达基因主要富集在TLR4/NF-κB、PI3K/AKT等信号通路。通过体外细首次建立了不同产地石上柏药材双黄酮的HPLC 指纹图谱，通过相似度计算、聚类分析和主成分分析，从多角度综合判断石上柏药材的质量；细胞筛选，发现石上柏总双黄酮和穗花杉双黄酮对H9c2 心肌细胞缺氧复氧诱导的损伤具有良好的保护作用；它们能显著提高H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤后细胞存活率，同时还能抑制细胞凋亡率（P﹤0.05）；此外，穗花杉双黄酮能显著降低细胞上清液中LDH、CK-MB、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量（P﹤0.05）。体内药效结果显示，穗花杉双黄酮可显著降低大鼠心肌梗死体积和心肌细胞凋亡水平，同时还可降低大鼠血清中心肌酶(LDH、CK-MB)水平及相关炎性指标IL-1β、IL-6及TNF-α的水平；此外，与I/R组相比，穗花杉双黄酮处理后不仅可以提高AKT的磷酸化，还呈剂量依赖性地抑制了NF-κB的磷酸化；通过分子对接证明了穗花杉双黄酮与NF-κBp65之间具有较强的亲和力，结合能为−7.6kcal/mol，表明AME可直接与NF-κBp65结合，影响NF-κBp65的进一步磷酸化。. 以上结果表明，穗花杉双黄酮在处理心肌缺血再灌注损伤方面具有良好治疗潜力，本研究为新型天然药物用于治疗心肌缺血再灌注损伤的研究提供实验基础和新思路。. 根据以上结果共发表23篇文章，其中SCI收录16篇，授权3项国家发明专利。