玉米Opaque7突变对醇溶蛋白合成调控的分子机理研究

醇溶蛋白是玉米籽粒储藏蛋白的重要组成，醇溶蛋白的成分和含量是决定玉米品质的重要性状。玉米胚乳的粉质突变体为研究该性状提供了重要的研究资源。目前，虽已克隆了部分改变醇溶蛋白成分和含量的玉米胚乳粉质突变基因，但对醇溶蛋白的合成调控以及粉质胚乳的形成机制还不清楚。Opaque7是玉米中经典的粉质胚乳突变，我们通过图位克隆的方法克隆了Opaque7(o7)基因，初步分析表明该基因既不是醇溶蛋白的直接调控基因也不是醇溶蛋白的结构基因，可能以全新的方式影响醇溶蛋白的合成。本申请拟在此基础上，利用功能互补、RNAi、过量表达以及模式植物同源基因RNAi来解析o7基因。同时，通过o7/o7突变体与野生型的RNA以及蛋白水平分析该基因突变对其它基因的调控与影响。最后通过共定位技术确认O7的亚细胞定位，结合O7基因转录水平和蛋白水平的分析，找出其可能参与以及调控的生化路径，解析醇溶蛋白合成调控的新方式。

玉米中，一系列的胚乳粉质突变可以通过降低籽粒中主要的储藏蛋白－醇溶蛋白的合成，从而增加赖氨酸的含量。对这些粉质突变基因的克隆将有助于解析玉米籽粒中醇溶蛋白合成和调控的机理。Opaque7(O7)突变体作为玉米中一个经典的非致死突变，通过影响玉米籽粒中19kDa和22kDaα醇溶蛋白的合成和积累有效提高了赖氨酸的含量。本研究中，通过图为克隆的方法克隆了O7基因。序列分析表明，该基因在第二个外显子上缺失了12个碱基从而造成所编码的蛋白质缺失了4个氨基酸，4个氨基酸的缺失导致了蛋白稳定性显著降低，影响了O7蛋白的有效积累。转基因功能互补和RNAi的方法确认了该基因。O7编码了一个酰基活化酶(Acyl-Activating enzyme3 AAE3)。该基因在籽粒中高表达，所编码的酶专一性地参与了细胞中草酸的活化。生化和细胞学分析表明，O7突变体中α醇溶蛋白合成的减少造成的蛋白体数目和体积的下降导致了O7表型的产生。氨基酸和代谢产物的分析表明，O7基因通过影响α－酮戊二酸和草酰乙酸的合成影响了氨基酸的代谢，从而下调了醇溶蛋白的合成。通过RNAi下调玉米与水稻中的AAE3均能造成蛋白合成的下降从而产生Opaque表型，表明该基因在玉米与水稻中功能保守。该基因在玉米与水稻中的功能保守，通过RNAi下调玉米与水稻中的AAE3均能造成蛋白合成的下降从而产生Opaque表型。为了验证氨基酸缺陷可以抑制醇溶蛋白的合成，我们克隆了proline responding1 (pro1)基因，Pro1基因编码一个△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(△1-Pyrroline-5- carboxylate synthetase P5CS)，它是催化以谷氨酸为前体合成脯氨酸过程中的限速酶，Pro1功能的丧失，造成突变体中脯氨酸合成与积累的下降。脯氨酸的缺乏造成pro1突变体细胞中空载tRNApro AGG累积，由此引发真核生物翻译起始因子2(eukaryotic initiation factor 2)的α亚基(eIF2α)磷酸化，从而影响了蛋白质的翻译效率，抑制了醇溶蛋白的合成。自然界存在着o7基因的修饰基因，o7，pro1和o7基因修饰基因的克隆和功能分析将更全面地解析醇溶蛋白合成调控的机理。