SPINK1/Spink3对胰腺外分泌腺泡细胞自噬现象产生负调节作用的相关关键蛋白的探索

Through the analysis of EGFR "conditional" knockout mice（Spink3-Cre;EGFR f/f）and the screening of the genome wide mRNA gene expression and subsequent some dozen of siRNAs interference, this research project aims at finding the associated key proteins both in vivo and vitro reacted directly or indirectly with SPINK1/Spink3 which is involved in the negative regulation of autophagy in pancreatic exocrine acinar cells. The most probable protein found via the ways mentioned above has to be reconfirmed using some protein-function analytical experiments, such as, the coimmunoprecipitation ,the siRNA knockdown assay and the generation of the corresponding dominant negative mutant construct,etc. Through exploring the connection between SPINK1/Spink3 and the correspondingly related proteins, the outcome of the investigation will lay the ground for elucidating the mechanisms and the signalling pathway involved in the negative regulation of autophagy by SPINK1/Spink3. Consequently, the new and possible protein targets as well as the corresponding ways and strategies would be possibly used and for the treatment of acute and chronic pancreatitis.

本课题采用EGFR受体条件敲出小鼠（Spink3-cre;EGFR f/f）模型、和基因组大范围mRNA筛选结合少量siRNA筛选等方法，在体内和体外实验水平上，寻找和发现SPINK1/Spink3对胰腺外分泌腺泡细胞自噬现象产生负调节作用的其中相关关键蛋白，为揭示SPINK1/ Spink3和相关蛋白之间的相互关系，阐明其对胰腺组织自噬现象产生负调节作用的机制及传导通路的进一步研究奠定基础，从而为胰腺炎的治疗提供新的可能作用的靶位，开拓新的的思路和方法。

中文摘要：此研究在EGFR条件敲出鼠（EGFR仅在小鼠胰腺外分泌细胞中缺失）体内实验中，排除了SPINK1/Spink3与EGFR结合对胰腺自噬现象的负调节的可能性。同时体外实验显示除EGFR外，SPINK1/Spink3可能结合于AsPC-1细胞表面其它的受体和胞浆蛋白而促进细胞增生。条件敲除Egfrf/-;Sp3Cre/+ 鼠由Egfrf/- 和 Spink3Cre/+ 交配产生，其实验组胰腺大体标本和镜下H.E染色和对照组相比未见异常，即未见胰腺自噬现象发生。自噬严重程度标志物LC3I/LC3II的比率与对照相比无统计学差异。Western显示实验组胰腺组织ERK1/2和AKT磷酸化无改变，提示EGFR缺失后，MAPK/ERK和 PI3K/ AKT /-mTOR信号传导通路未受影响。EGFR家族其他成员Her2、Her3也未见“代偿性”的表达增高。体外实验显示在EGFR磷酸化被EGFR络氨酸激酶抑制剂AG1478完全抑制后，人重组蛋白rhSPINK1仍可促进AsPC-1细胞增生，而且增生的程度与不加AG1478相比无统计差异，提示SPINK1可能结合于AsPC-1细胞表面其他的受体或胞浆蛋白，激活其特有的信号传导途径。人重组rhEGF蛋白和人重组rhSPINK1蛋白共同作用可促进AsPC-1细胞的增生，这种作用要大于单独加rhEGF或rhSPINK1，表明rhEGF和 rhSPINK1对AsPC-1细胞增生起一种叠加作用，两者不是一种竞争性关系，提示EGF和SPINK1可能有不同的作用途径。. 以上体内体外数据表明：SPINK1/Spink3不是通过与EGFR结合对胰腺自噬现象的负调节，可能是通过胰腺外分泌细胞表面其它的受体或胞浆蛋白调节自噬。基因组范围的mRNA芯片实验设计理论上“屏蔽”了EGFR产生的信号，在转录体水平上缩小了与SPINK1/Spink3调节自噬的相关关键蛋白的范围，目前实验在送检和分析当中。