基于胰腺腺泡细胞自噬通路受阻理论的靶向蛋白激酶治疗抑制胰蛋白酶原细胞内激活的作用及机制研究

During the research process of previous two microfinance projects of National Natural Science Foundation of China, we found that autophagy and protein kinases play an important role in the occurrence and development of acute pancreatitis (AP). Recent studies show that the impairment of autophagy due to lysosomal dysfunction is the initial factor of intracellular activation of trypsinogen in AP. Protein kinases play a significant role in regulating the function of autophagy. These findings suggest that there may be some causal relationship among the four events in the process of protein kinases-autophagy-intracellular activation of trysinogen-AP. In previous work, we have screened out 4 candidate kinases, which play a key role in the process of intracellular activation of trypsinogen from 512 protein kinases using rat kinase siRNA Libraries. On this basis, in this project we will first use RNA interference to validate the key role of the 4 candidate kinases and further screen out 2 candidate kinases which have more important role than the other two. Subsequently, cell and animal experiments will be carried out to evaluate the efficacy of the targeting protein kinase treatment for acute pancreatitis, and to intensively study how the candidate kinases-targeted therapy intervene the impaired autophagy, then the intracellular activation of trysinogen is inhibited. Our project is to explore the feasibility of protein kinase as a new target for treatment of AP, which is expected to provide a new idea for the studies on the treatment of pancreatitis.

在前两项国家自然科学基金小额项目的研究过程中我们发现自噬和蛋白激酶可能在急性胰腺炎（AP）的发生发展过程中发挥着重要的作用。新近研究认为自噬通路受阻是AP胰蛋白酶原细胞内激活的始动因素。蛋白激酶对自噬通路有重要的调控作用。以上发现提示我们，蛋白激酶-自噬-胰蛋白酶原细胞内激活-AP间可能存在某种程度的因果调控关系。 在前期工作中，本课题组以激酶组siRNA文库法从512个大鼠激酶中筛选出4个在胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原激活过程中起关键作用的候选激酶。在此基础上，本课题拟首先利用RNA干扰技术对4个候选激酶的关键作用进行验证，并进一步筛选出作用相对较强的2个候选激酶。之后，分别在细胞和动物水平评价靶向候选激酶治疗AP的效果，并深入研究靶向候选激酶治疗是如何通过干预受阻的自噬通路抑制胰蛋白酶原的细胞内激活的。 本课题拟对蛋白激酶作为AP治疗新靶标的可行性进行探索，以期为AP治疗的研究提供新思路。

新近研究认为溶酶体功能障碍致自噬通路受阻是AP胰蛋白酶原细胞内激活的始动因素。蛋白激酶对自噬通路有重要的调控作用。故本课题拟对蛋白激酶作为AP治疗新靶标的可行性进行探索，以期为AP治疗的研究提供新思路。. 主要研究内容及重要成果如下：①本课题组通过对与急性胰腺炎相关的蛋白激酶的文献挖掘共找到28个激酶，基于GEO数据库的生物信息学分析筛选出29个激酶，TLC-S作用后AR42J细胞全基因组芯片检测筛选出22个激酶，激酶siRNA文库反式转染高通量筛选候选激酶，最后筛选出MAPK1，PKC-alpha，JAK2，LYN四个激酶。②针对这4个候选激酶进行RNAi后流式细胞检测胰蛋白酶原激活的验证结果显示沉默MAPK1，JAK2，LYN对胰蛋白酶原激活的抑制具显著意义。③mRNA＋microRNA整合分析显示rno-miR-352调控功能主要富集于“溶酶体”，rno-miR-352干预实验证实了其对胰蛋白酶原激活、自噬发生、溶酶体功能具有调节作用。④本课题证实了沉默MAPK1对胰蛋白酶原的细胞内激活及自噬流的影响，筛选出了激酶抑制剂PD98059，并在动物实验和细胞实验中证实了其对急性胰腺炎的病情（病理学评分、血淀粉酶），胰蛋白酶原激活（胰蛋白酶原激活肽TAP、BZiPAR荧光染色激光共聚焦显微镜及流式细胞检测），自噬发生（LC3-II、Beclin1蛋白表达），溶酶体功能（LAMP2和CTSL1蛋白表达、CTSL1蛋白活性检测、溶酶体pH值测定、mRFP-GFP-LC3转染激光共聚焦显微镜检测自噬流）具有调节作用。. 综上所述本课题证实了胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原激活过程中伴随着胰腺腺泡细胞自噬发生的增强和自噬流受阻及溶酶体功能障碍。沉默激酶MAPK1或使用激酶抑制剂PD98059对急性胰腺炎的发生具有保护作用，其保护机制可能通过改善胰腺腺泡细胞内受阻的自噬下游通路，减少胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原的激活程度，从而减轻胰腺损伤。. 在本课题的资助下，发表SCI收录论文9篇，最高影响因子6.359。培养博士研究生1人，硕士研究生4人，皆有标注本课题号的署名SCI收录文章发表。