基于褐牙鲆卵壳前体蛋白的海洋环境雌激素生物标志物检测技术

The contamination of environmental estrogens in marine has posed adverse impacts on wildlife and human health. Estrogenic chemicals (including 17β-estradiol (E2) and ethinylestradiol) are capable of interfering with endocrine and reproductive systems at a concentration below 10 ng/L, causing severe damage to marine organisms. Therefore, it is urgent to develop sensitive and simple techniques for detecting trace environmental estrogens in marine environment. Choriogenin (Chg) has been proved to be a sensitive biomarker of environmental estrogens, but the method for accurate quantification of Chg has not been established. In this study, bastard halibut (Paralichthys olivaceus), a widely distributed marine fish on the China coast, is chosen as the test organism. Its Chg will be prepared by prokaryotic express, and purified for producing highly specific and sensitive monoclonal/polyclonal antibodies. Then, the purified Chg and antibodies will be used to develop Chg sandwich ELISA and colloidal gold immunoassay, which are expected to detect estrogen activity equal to 1 ng/L E2 or even below. The effectiveness of both methods for estrogenic activity detection will be verified by laboratory exposure experiments, and the results will provide useful technology for monitoring marine pollution of environmental estrogens.

海洋环境雌激素污染日益严重，对野生动物与人类健康造成了威胁。雌二醇(E2)、雌炔醇等雌激素类物质在低于10ng/L的浓度下就能干扰内分泌与生殖系统，对生物体造成严重危害，因此亟需开发灵敏、简便的海洋微量环境雌激素检测技术。鱼类卵壳前体蛋白(Choriogenin, Chg)被证实是一种环境雌激素的敏感生物标志物，但是目前尚未建立准确定量Chg的方法。本项目拟以我国沿海广泛分布的褐牙鲆为实验对象，采用原核表达技术制备重组Chg，解决常规方法无法从鱼体内获得高纯度Chg的难题。利用纯化的Chg制备高特异性、高敏感度的单/多克隆抗体，开发灵敏、精确的Chg夹心ELISA与快速、简便的Chg免疫胶体金层析技术，达到检测1 ng/L甚至更低E2水平的雌激素活性，并通过实验室暴露实验对两种方法进行验证和应用，以期为我国海洋环境雌激素活性的检测提供可业务化的技术与方法。

海洋环境雌激素污染是当下备受关注的环境问题，我国近岸海水中时常检测到了雌二醇(E2)、乙炔雌二醇(EE2)、双酚A等雌激素类化合物。这类污染物在ng/L的水平下就会对水生动物造成严重危害，包括性腺发育异常、生殖力下降、雄鱼雌性化等现象。为减少这类物质对人类与野生动物的危害，亟需建立灵敏、准确、简便的海洋环境雌激素检测技术。鱼类卵壳前体蛋白(Choriogenin, Chg)是近年来新发现的环境雌激素生物标志物，被认为能够用于检测水体中微量的环境雌激素，但是至今缺少可靠的检测技术。针对这一难题，本项目以黄渤海广泛分布的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)为研究对象，开展鱼类Chg的免疫检测技术研究。首先，利用cDNA末端快速扩增试剂盒(RACE Kit)克隆获得了Chg H与Chg L的基因全长，其中Chg L为1609 bp，开放阅读框为1473 bp，编码490个氨基酸，分子质量为52.22 kDa；组织分布特征结果显示Chg H与Chg L在肝脏和脾脏中的表达量最高，并且2 ng/L EE2暴露下褐牙鲆幼鱼肝脏中Chg L的表达量要明显高于Chg H，表明Chg L对外源雌激素具有更高的灵敏度。随后，利用原核表达技术制备了褐牙鲆Chg L蛋白，解决目前传统方法难以从鱼体纯化获得Chg的问题。利用纯化的Chg蛋白制备了单/多克隆抗体，并且开发了定量褐牙鲆Chg的夹心ELISA，其标准曲线工作范围为31.25~4000 ng/mL (R2>0.97)，检出限约为3.1 ng/mL，能够检测到2 ng/L EE2暴露下褐牙鲆幼鱼血浆的Chg L诱导量。本课题还利用胶体金颗粒标记单克隆抗体，在对pH与标记蛋白含量优化的前提下制备了褐牙鲆Chg的免疫胶体金试纸条，其检出限为7.3 ng/mL，标准曲线工作范围为15~500 ng/mL(R2>0.9738)。该免疫胶体金试纸条能在10 min以内快速检测褐牙鲆血浆中的Chg，是一种便于携带、敏感、简便的环境雌激素生物标志物检测技术。综上，本研究不仅开发了褐牙鲆Chg的夹心ELISA试剂盒，为准确检测微量环境雌激素活性提供了灵敏方法，还研发了快速、简便的褐牙鲆Chg免疫胶体金层析技术，实现了海洋环境雌激素的现场检测。以上方法的建立有望为我国海洋环境雌激素活性的业务化监测提供可靠工具。