内核膜蛋白SUN1作用于mRNA核输出通路的机制研究

Abnormalities in the nuclear mRNA export pathway can cause a series of human diseases, including cancer. Due to the diversity of nuclear mRNA export pathway and the limited drug development, various diseases associated with the malfunction of nuclear mRNA export pathway cannot be treated accurately. It is very important to understand the molecular mechanism of nuclear mRNA export pathway in order to treat these diseases effectively. In this proposed study, the knockdown technique will be used to create HeLa cells deficient in SUN1, an inner nuclear envelope protein. The RNAseq and bioinformatic methods will be used to analyze and characterise any changes in cytoplasmic mRNAs. The phosphorylation status of SUN1 will be analyzed with biochemical and cell biological methods to determine whether SUN1 can be phosphorylated by aPKC, the crucial amino acids for phosphorylation if any, the effect on the interaction of SUN1 with NXF1 (nuclear export factor 1) and Nup153 (nucleoporin 153), and on nuclear mRNA export. In addition, CRISPR-Cas9 DNA editing tool will be employed to generate mutants of SUN1 in zebrafish. The SUN1 mutant zebrafish will be then extensively analyzed for the genetic, biochemical and cellular characteristics. Taking together, the results to be obtained by the completion of this proposal will provide: 1) a better understanding for the molecular mechanism of SUN1 function in mRNA export pathway; 2）the new insight for drug screening and clinical precision treatment of related diseases.

mRNA核输出通路的异常会引起一系列相关疾病的发生，包括癌症。由于mRNA核输出通路的多样性和新药研发的局限性，使这些疾病得不到针对性治疗，因此，深入研究mRNA核输出通路的分子机制具有重要意义。本研究拟应用Knockdown技术制备SUN1缺失的HeLa细胞，利用RNAseq和生物信息学的方法分析胞质差异mRNA的类型及特征。通过生物化学和细胞生物学的手段检测SUN1是否可以被aPKC所磷酸化及其磷酸化的关键位点，这些位点的突变体与NXF1和Nup153的结合能力是否发生改变以及突变体对mRNA核输出的影响。借助CRISPR-Cas9基因编辑技术制备SUN1缺失或突变的斑马鱼突变体，分析突变体的遗传、生化和细胞学表型。结合细胞水平的研究，深入探索SUN1作用于mRNA核输出的分子机制。该研究一方面充实了mRNA核输出通路的基础理论；另一方面为相关疾病的药物筛选和临床精准治疗提供了新思路。

SUN1作为内核膜蛋白参与mRNA核输出通路，但其作用机制尚不清楚。因此本项目围绕SUN1作用于mRNA核输出通路的分子机制这一科学问题开展研究，主要取得以下结果：.（1）阐明了SUN1影响哪些mRNA的核输出.采用细胞核质分离技术、Western blot、qRT-PCR及RNAseq，将SUN1敲低细胞的胞质mRNA进行转录组测序，利用生物信息学技术对这些mRNA分类，结果表明SUN1对mRNA核输出的影响具有普遍性。.（2）探讨了SUN1在传递NXF1-mRNP复合物的过程中是否需要被磷酸化.使用Netphos 3.1预测软件寻找潜在的磷酸化位点，在SUN1的N端S110和S113处发现PKC识别基序R/KXpSXR/K的两个重叠拷贝。一系列免疫共沉淀实验结果表明SUN1确实是aPKC的底物。使用不同浓度的aPKC抑制剂Staurosporine处理细胞，结果表明，aPKC确实参与SUN1的磷酸化。将SUN1的S110和S113位点分别突变成丙氨酸，再进行aPKC底物识别的检测，结果发现，与单一S110A突变相比，PKC磷酸化底物抗体不再识别S113A和S110A/S113A双突变，表明SUN1的S113位是被aPKC磷酸化的位点。.（3）分析了SUN1被aPKC磷酸化的作用.将GST-SUN1-NT中的S110、S113和S110/S113突变为D残基，蛋白质互作实验结果表明，aPKC通过磷酸化SUN1的S113而减弱SUN1与NXF1的相互作用，但并不影响其与Nup153的结合。并且，FISH实验表明，与野生型蛋白相比，SUN1基因敲低后，携带S113A突变的GFP-SUN1不能高效地恢复mRNA核输出，而类似于磷酸化状态的GFP-SUN1-S113D则可以高效地恢复mRNA的核输出。.（4）建立了SUN1缺失的斑马鱼突变体并进行细致的表型分析.应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼sun1和sun2的缺失突变体。通过显微注射结合测序的方法，成功获得了2个sun1缺失突变体和2个sun2缺失突变体。这些突变体的纯合子和杂合子均可以正常发育，没有明显的表型，这与小鼠敲除后的结果一致，可能是由于sun1和sun2在功能上互补，并且在斑马鱼中没有发现明确的sun2蛋白，因此对双突变体的构建及表型分析显得尤为重要。