静电纺丝纳米纤维生物膜合成茶氨酸的机理研究

茶氨酸具有重要的生理生化功能和药理保健功效。项目利用静电纺丝技术，以我们刚结题的一个面上基金项目为起点，对超量表达谷氨酰胺合成酶的大肠杆菌进行固定化，以期获得稳定性高、传质阻力小、负载量大、产物易分离等高催化效率的固定化纳米生物膜，通过运用先进的纳米纤维固定化技术提高茶氨酸酶法转化的催化效率。同时从茶树中茶氨酸合成酶的表达、纯化及晶体结构解析出发，通过与谷氨酰胺合成酶晶体结构的比对，根据酶的结构和功能的关系分析、酶分子的定点突变和酶与底物亲和力大小的等温滴定量热法的测定，对不同物种合成茶氨酸的酶学机理进行研究，有望解决目前茶氨酸合成过程中酶与底物的亲和力及产物转化率均较低的工业化现状。这将对揭示不同物种生物体内茶氨酸的合成具有重要理论意义，并为开发具有重要药理作用和保健活性的茶氨酸奠定前期研究基础。

茶氨酸具有重要的生理生化功能和药理保健功效。项目利用静电纺丝技术，对超量表达谷氨酰胺合成酶的菌株进行固定化，得到了纤维平均直径为220nm纳米活性膜，该膜具有稳定性高、传质阻力小、负载量大、产物易分离等特性。通过运用先进的纳米纤维固定化技术获得茶氨酸酶法转化效率为10.74g/L。同时从茶树中茶氨酸合成酶的表达、纯化及晶体结构解析出发，通过与谷氨酰胺合成酶晶体结构的比对，根据酶的结构和功能的关系分析、酶分子的定点突变和酶与底物亲和力大小的等温滴定量热法的测定，对不同物种合成茶氨酸的酶学性质及机理进行研究。获悉谷氨酰胺合成酶的绝大部分残基的主链构象角落在经验值内，每个单元中含有20个亚基，按照五元环的形式组成了一个由四个环组成的桶状结构；其单体是由N端的5个反向的β-sheet组成的β-grasp domain以及C端的catalytic domain组成。其中一个亚基的catalytic domain与相邻亚基的β-grasp domain相互作用，从而形成了一个五元环的结构，这样每一个五元环的结构中存在着5个活性位点。通过其它细节的比对发现在C端的His70-Ile74和Ar9292-Ser30 1上。His70一Ile74的变化可以解释为GS在不结合ADP会采取一种开放型的结构。Ar9292一Ser301为缺失电子云图的一段，意味着这一段在酶的结构上是非常不具有稳定性的一段。结合Eisenberg．D提出的GS的作用机理，推断Ar9292-Ser301的功能为控制反应底物进入活性位点。进而通过酶的结构修饰，提高其与底物的亲和力，获得茶氨酸的合成产量为18.10 g/L，实现谷氨酸的转化率为34.6%。克服目前茶氨酸合成过程中酶与底物的亲和力及产物转化率均较低的生产缺陷。这些对揭示不同物种生物体内茶氨酸的合成具有重要理论意义，并为开发具有重要药理作用和保健活性的茶氨酸奠定前期研究基础。